[發明專利]尿液診斷膀胱癌的方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201110287529.2
• 申請日: 2011-09-23
• 公開（公告）號: CN102311953A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發明（設計）人: 余堅;王紅陽;顧健人;楊勝利;趙仰星;孫晉楓;張紅宇;顧峻;王韋;何英華;郭士成
• 申請（專利權）人: 上海市腫瘤研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發明涉及生物醫學檢測；更具體地，本發明涉及新的膀胱癌生物標志物(尿液標志物)，以及基于所述標志物的膀胱癌診斷試劑和試劑盒。?

背景技術

癌癥被認為是一種遺傳性疾病的觀念在腫瘤研究領域持續幾十年了。隨著人類基因組計劃的圓滿完成，癌基因組計劃已經在美國開展，這項計劃旨在繪制五十種人類常見的癌癥的相關突變體和SNP的詳細遺傳學圖譜。最近幾次系統的大規模測序證實了癌組織中體細胞的突變數量明顯少于預期，這些結果暗示癌癥遠非一種遺傳性疾病，越來越多的證據表明表觀遺傳調控的細小變化在腫瘤中的重要作用。?

表觀遺傳學(Epigenomics)是研究基因在不發生DNA序列改變的情況下，基因功能發生的可遺傳的變化，并最終導致了表型的變化的一門學科。表觀遺傳學主要包括DNA甲基化(DNA?methylation)，組蛋白修飾(histone?modification)，microRNA水平變化等生化過程；DNA甲基化是研究較為深入的表觀遺傳學機制，在包括診斷和治療在內的腫瘤臨床實踐中有著重要的應用前景。DNA甲基化是指生物體內在DNA甲基轉移酶(DNA?methyltransferase，DMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基轉移到特定的堿基上的過程。DNA甲基化可以發生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鳥嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等。但在哺乳動物中DNA甲基化主要發生在5’-CpG-3’的C上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。?

在基因組中98％以上的CpG二核苷酸散在的分布位于具有轉錄依賴性的轉座潛能的重復序列中。在正常細胞中，這些CpG處于高度甲基化/轉錄沉默的狀態，而在腫瘤細胞中這些CpG發生了廣泛的去甲基化，導致重復序列的轉錄、轉座子的活化，基因組的高度不穩定性和原癌基因轉錄增強。余下的占總量2％左右的CpG密集地分布于較小的區域(CpG島)。約40％-50％的基因啟動子區域或其附近存在CpG島，暗示DNA甲基化可能參與該類基因轉錄調控機?制。在腫瘤細胞中，這些原本在正常細胞中處于低甲基化狀態的CpG島會發生高甲基化而導致基因的轉錄失活。受影響的基因包括DNA修復基因，細胞周期控制基因和抗凋亡基因等抑癌基因。因此這種腫瘤細胞DNA異常甲基化譜式，已經成為一個新的腫瘤生物標志物研究領域。基因組DNA經亞硫酸氫鹽處理后，進行PCR(甲基化特異PCR，MSP)檢測可有效地確定受試DNA片段的特定位點的甲基化狀態，作為一種定性分析手段，MSP可從含10000個正常細胞的復雜臨床樣品中檢出個位數的甲基化異常的腫瘤細胞，只要這兩者受試DNA特定區域的甲基化狀態完全相反。這使其對體液中微量DNA進行甲基化分析來診斷腫瘤的方法成為很有希望的腫瘤標記物：如支氣管肺泡的沖洗液、糞便、血清/血漿，以及尿沉淀DNA(如膀胱癌的檢測)。?

膀胱腫瘤以膀胱移行細胞癌多見，60～69歲為發病高峰，膀胱癌在美國為第4的常見的男性腫瘤，為第8常見的女性腫瘤。而在中國的某些大城市，隨著工業化程度的加快和個人飲食，吸煙等生活習慣的改變，上海市在1973-1999這時間段中其發病率具有明顯上升趨勢。如果能在膀胱癌的早期做出診斷，病人的5年存活率將高達95％，而當膀胱癌形成多處擴散，或遠處傳播則5年生存率降至僅49％。目前醫院普遍采取的膀胱癌檢查手段為：B超，膀胱內窺鏡和組織活檢。B超易受膀胱其他疾病如膀胱息肉、膀胱粘膜下出血等影響，并且容易漏檢＜5mm的腫瘤或平鋪在黏膜表面不向腔內突出的病例。而膀胱內窺鏡和組織活檢為有創檢查，無法作為普遍性的早期體檢和高危人群篩檢，此外，尿脫落細胞形態學檢查檢出率較低，且對早期Ta、T1期膀胱癌檢出率為0。雖然近年來又發展了一些新的膀胱癌輔助檢測技術如核基質蛋白-22、膀胱腫瘤抗原、survivin、微衛星不穩定等，其中前兩項已被美國FDA批準作為膀胱鏡輔助檢查，但這些技術都存在技術復雜或靶點單一等缺點，如何在形成肉眼可見腫瘤前進行診斷還是一大難題。所以發展一種新的膀胱癌早期篩查手段或輔助檢查技術就顯得非常必要。?

尿液中常見細胞為紅細胞、白細胞、吞噬細胞、上皮細胞等，且總量可觀，大約每50毫升中有20萬左右。膀胱癌病人的尿液中混有少量脫落的腫瘤細胞。鑒于MSP的敏感性，其可以從10000個正常的alleles中檢測出個位數的甲基化allele的敏感性。所以抽提受檢者尿樣中的細胞DNA以檢測特定基因的甲基化狀況是可行的，本發明人的前期膀胱癌相關工作已于2008年申請專利，專利申請號200710044106，但是之前的工作針對的樣本量較少。?