[發明專利]用釀酒酵母測定直接染料急性毒性的方法

無效

• 申請號: 201110286244.7
• 申請日: 2011-09-25
• 公開（公告）號: CN102344948A
• 公開（公告）日: 2012-02-08
• 發明（設計）人: 譚之楊
• 申請（專利權）人: 武漢紡織大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.用釀酒酵母測定直接染料急性毒性的方法，其特征是：在無菌條件下由以下步驟實現：

1）制備酵母懸液：將釀酒酵母凍干粉或平板培養的釀酒酵母菌落或液體培養的釀酒酵母用無菌純凈水配制或調整成細胞密度約為1.0×10^4?個?/ml的釀酒酵母菌懸液（一種染料至少需要1000?μl菌懸液），放入4℃冰箱中備用；

2）配制染料溶液：用編號的1.5?ml連蓋離心管、單道可調20-300?μl量程移液器配合20-300?μl吸頭配制；染料溶液的最大濃度等于或略小于該直接染料的溶解度，但不大于20000?mg/l；用量為每管130?μl；并按3倍系數進行梯度稀釋，共稀釋10次，得到11種濃度的直接染料待測溶液共2組，見圖1；

3）建立培養體系：由2組每組12個1.5?ml連蓋離心管構成，每組前11個離心管均為待測染料溶液，每組最后1管用無菌純水代替待測染料溶液，其成分構成分別為：待測染料溶液∶YPD(YEPD)液體培養基(2.2倍)∶釀酒酵母懸液=130?μl∶110?μl∶20?μl；均采用單道可調20-300?μl量程移液器配合20-300?μl吸頭加入；

4）進行細胞培養：蓋好離心管蓋，在溫度30?℃、轉速150?r/min條件下震蕩培養6-7.5小時；

5）計數懸液制備：將培養管放入小型離心機中，用4000?r/min離心10?min，棄上清液，用PBS(pH?7.4)緩沖液300?μl洗滌各細胞團2次（每次洗滌均是將細胞懸浮，然后立即離心并棄上清液），將各洗滌后的細胞團分別用PBS(pH?7.4)緩沖液配制成260?μl菌懸液；

6）測定細胞數目；用基于電阻法細胞計數原理的手持式細胞計數器測定各管菌懸液的細胞濃度；或用平板菌落計數法測定各管菌懸液的菌落形成單位(clone?forming?unit,?CFU)；

7）求算染料EC₅₀范圍：將所測得的各管菌懸液的細胞濃度減去初始細胞濃度，除以對照管菌懸液的細胞濃度，或將所測得的各管菌懸液的CFU減去初始CFU，除以對照管菌懸液的CFU，并換算成百分數，定義為細胞分裂率；將相同濃度染料的細胞分裂率平均，將染料濃度除以2所得數值為橫坐標、平均細胞分裂率為縱坐標繪圖，得到一條曲線，通過縱坐標上的一點(0,50)作X軸的平行線，交曲線于A點，過A點作Y軸的平行線，交X軸于B點，B點的橫坐標數值即為所求染料的EC₅₀值，但一般尚難以確定，故將B點附近對應的染料濃度分別記為L和H，X軸上的線段LH所對應的染料濃度即為染料EC₅₀范圍，見圖2；

8）測定和求算染料EC₅₀：重復步驟2)至步驟7)，但步驟2)中的梯度稀釋系數需根據染料EC₅₀范圍重新確定，即：分別將L和H以科學計數法表示(a×10的n次冪的形式)，分別將a取整，得到L’和H’，以L’和H’為再次測定過程中的染料溶液的濃度范圍；B1點的橫坐標數值即為所求染料的EC_50-粗略值，見圖3，并將B1上下兩個濃度值分布記為L₁和H₁，將線段L₁H₁分成10等份，觀察B1對應的小刻度數值，并記為b；然后根據公式(H₁-?L₁)÷10×b計算出EC₅₀值，見圖4。

2.根據權利要求1所述的用釀酒酵母測定多種直接染料急性毒性的方法，其特征是，用96孔細胞培養板(或酶標板)代替1.5?ml連蓋離心管、8道可調20-300?μl量程移液器代替單道可調20-300?μl量程移液器、小型冷凍高速離心機換上96孔酶標板吊籃轉子，則每兩個96孔板可求得4種染料的EC₅₀。