[發(fā)明專利]一種基因拷貝數(shù)變異的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110284638.9
• 申請(qǐng)日: 2011-09-22
• 公開（公告）號(hào): CN102409088A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭奇?zhèn)?/a>;周裕林;左正宏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 郭奇?zhèn)?/a>
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 廈門市首創(chuàng)君合專利事務(wù)所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用相似序列結(jié)合高分辨熔解曲線分析進(jìn)行基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)的方法。

背景技術(shù)

拷貝數(shù)變異(Copy?Number?Variations，CNVs)最初是70年前在果蠅Bar基因研究中發(fā)現(xiàn)的，后來被認(rèn)為是動(dòng)植物基因組中普遍存在的現(xiàn)象，它是指基因組DNA中較大片段的缺失或重復(fù)現(xiàn)象。有些拷貝數(shù)變異屬于多態(tài)性范疇，并不對(duì)動(dòng)植物的表型造成影響，而有些拷貝數(shù)變異則通過擾亂基因序列和改變基因含量來影響基因表達(dá)，從而造成表型差異和表型適應(yīng)，也會(huì)引起疾病。保守估計(jì)至少10％的人類基因組序列存在拷貝數(shù)變異的現(xiàn)象。當(dāng)功能基因區(qū)域如SMN基因、HER2基因等發(fā)生拷貝數(shù)變異時(shí)，可能導(dǎo)致基因產(chǎn)物數(shù)量的異常，從而導(dǎo)致非正常表型的出現(xiàn)，引起相關(guān)的疾病如脊髓性肌萎縮(SMA)、乳腺癌等。染色體非整倍體(Aneuploidy)也是一種典型的拷貝數(shù)變異現(xiàn)象，體細(xì)胞內(nèi)缺失或增加的染色體往往導(dǎo)致危害程度不同的病征，如特納綜合征(45，X)、克氏綜合征(47，XXY)、唐氏綜合征(47，+21)等。這類遺傳病不僅患病率極高，并且后天幾乎無法根治。因此，針對(duì)此類遺傳疾病，人群篩查與產(chǎn)前診斷顯得尤為重要。

目前應(yīng)用于拷貝數(shù)變異檢測(cè)的技術(shù)主要有：

1.比較基因組雜交(CGH)：該技術(shù)發(fā)展至今，已與芯片技術(shù)(Microarray)結(jié)合后衍生為芯片比較基因組雜交技術(shù)(Array-CGH)。該技術(shù)可以在全部染色體或染色體亞帶水平上，對(duì)不同基因組之間DNA序列的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)變異。然而該技術(shù)分辨率在Mb水平，更小片段的拷貝數(shù)片段則不易檢出。同時(shí)該技術(shù)操作繁瑣，通量低、耗時(shí)長(zhǎng)且成本昂貴，需要較為大量的模板DNA，不利于大范圍的推廣。

2.MLPA：全稱為多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)，是2002年發(fā)展起來的一種拷貝數(shù)檢測(cè)方法。目前已有相應(yīng)的試劑盒檢測(cè)如SMA、唐氏綜合征等疾病。該技術(shù)具有較準(zhǔn)確的相對(duì)定量功能。但是該方法探針制備較為復(fù)雜，同時(shí)操作步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)。并且采用毛細(xì)管電泳作為分析手段，通量較低、成本較高且屬于開放式操作，易于造成PCR產(chǎn)物的污染。

高分辨熔解曲線分析(High?Resolution?Melting，HRM)于2003年發(fā)明，是一項(xiàng)近年來備受關(guān)注的技術(shù)，其通過精確的變溫速率控制以及DNA飽和染料的指示，實(shí)現(xiàn)了通過研究PCR產(chǎn)物序列的熔解溫度而對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。由于該技術(shù)具有快速、廉價(jià)、高通量等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、基因突變(Mutation)和表觀遺傳學(xué)(Epigenetic)等研究。目前，已有將HRM應(yīng)用于基因拷貝數(shù)變異研究的報(bào)道，但均是通過檢測(cè)待測(cè)序列內(nèi)部的SNP位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)的。其原理是待測(cè)基因在某個(gè)SNP位點(diǎn)上是雜合子，當(dāng)發(fā)生拷貝數(shù)變異時(shí)，該SNP位點(diǎn)的雜合比例發(fā)生了變化，從而在HRM分析中體現(xiàn)出差別。采用該原理具有以下一些不足之處：首先，該方法實(shí)現(xiàn)的前提是SNP位點(diǎn)必須是雜合的，否則HRM無法區(qū)別兩個(gè)等位基因序列。這就使得單個(gè)SNP位點(diǎn)僅能用于一部分待測(cè)群體，而要囊括所有待測(cè)群體則必須采用多個(gè)SNP位點(diǎn)聯(lián)合檢測(cè)，這不僅增加了實(shí)驗(yàn)的成本和設(shè)計(jì)的難度，而且降低了檢測(cè)的通量。并且，單個(gè)核苷酸的差異對(duì)于熔解曲線的影響較小，甚至于有些差異幾乎不影響熔解曲線的偏移。這是造成檢測(cè)靈敏度較低的主要因素。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基因拷貝數(shù)變異的檢測(cè)方法。該方法是利用相似序列結(jié)合HRM分析進(jìn)行基因拷貝數(shù)變異的檢測(cè)。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

1)根據(jù)待測(cè)基因序列在全基因組范圍內(nèi)篩選相似但不相同的內(nèi)源性相似序列(內(nèi)標(biāo)法)或者根據(jù)待測(cè)基因序列人工合成相應(yīng)的外源性相似序列(外標(biāo)法)。

2)將待測(cè)基因序列與相似序列進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)共同的擴(kuò)增引物。如有需要，還可設(shè)計(jì)相應(yīng)的非標(biāo)記探針。

3)采用共同的引物進(jìn)行PCR，在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增待測(cè)基因序列與相似序列。

4)HRM分析PCR產(chǎn)物。

所述相似序列與待測(cè)基因序列可以是同源關(guān)系，也可以是非同源關(guān)系。

所述相似序列可與待測(cè)基因序列位于同一染色體上，也可位于不同染色體上。

所述相似序列包括經(jīng)表觀遺傳學(xué)研究方法如重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化(bisulfite?conversion)后形成的相似序列。

所述共同的擴(kuò)增引物可以是一對(duì)擴(kuò)增引物，也可以是多對(duì)擴(kuò)增引物多位點(diǎn)驗(yàn)證。

所述共同的擴(kuò)增引物與模板可以是完全匹配，也可以是不完全匹配。