[發明專利]一條編碼ADI的優化DNA分子及表達ADI的工程菌

有效

• 申請號: 201110282842.7
• 申請日: 2011-09-22
• 公開（公告）號: CN102321643A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 侯建華;楊璐
• 申請（專利權）人: 北京凱因科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12N9/80;C12R1/19
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技術領域

本發明涉及一條編碼ADI的優化DNA分子及含有所述優化DNA分子的工程菌，屬于生物技術領域。

背景技術

L-精氨酸是哺乳動物細胞很重要的營養物質，它也被支原體用作主要的非糖酵解能量來源。從被支原體感染的細胞培養物中得到的精氨酸脫亞胺酶(Aiginine?deiminase，ADI，EC?3.5.3.6)能夠降解精氨酸為瓜氨酸和氨水，該酶存在于很多種類的微生物中，ADI已被證明能夠抑制腫瘤細胞體外生長以及具有抗血管生成的活性。

人體正常細胞能夠通過瓜氨酸透過胞質酵素精氨基琥珀酸合成酶（ASS）及精氨基琥珀酸裂解酶（ASL）合成精氨酸。精氨酸的代謝途徑已被很好地描述，在膳食攝取中，精氨酸從肝門靜脈被肝吸收，并通過精氨酸酶迅速轉化為鳥氨酸，在后一過程中，形成尿素，從精氨酸產生的鳥氨酸然后轉化為瓜氨酸，或者可被代謝為谷氨酸鹽/酯和丙氨酸，或者形成的鳥氨酸摻入多胺化合物，例如，腐胺。未被代謝為鳥氨酸的膳食精氨酸可被加工為例如精氨酰-tRNA，用于蛋白合成。此外，存在通向精氨酸的內源合成途徑，后一過程主要在腎臟中發生，其中從鳥氨酸和瓜氨酸前體合成精氨酸。

人形支原體M.?arginini的ADI是一種能夠降解精氨酸的酶，其由arcA基因編碼，蛋白總量占M.?arginini可溶蛋白的10%，除了支原體M.?arginini以外，其它許多微生物如Mycoplasma?hominis、Mycoplasma?arthritidis、Mycobacterium?tuberculosis、Lymedisease?spirochetes和Streptococcus等都編碼ADI，后者催化精氨酸代謝為生物體提供能量。M.?arginini編碼的ADI是由410個氨基酸組成的球型生物大分子，分子量約為46000，等電點為4.7，沒有分子內二硫鍵，以二聚體形式出現。

氨基酸降解酶能通過解除胞外相關氨基酸的供給來抑制某些腫瘤細胞的增殖。人體部分腫瘤細胞缺乏精氨酸合成的相關酶，不能合成精氨酸（Cancer?Res?62:5443-5440)，屬于精氨酸營養缺陷型腫瘤細胞，這種不能表達精氨基琥珀酸合成酶的性質最近被科研人員所證實(Shen?L?J,?Lin?W?C,?Beloussow?K,?Shen?W?C.?2003)。肝癌、乳腺癌、黑素瘤等腫瘤是人體常見腫瘤，研究表明，這些腫瘤多是精氨酸營養缺陷型，這些腫瘤的細胞往往不能合成精氨酸，必須依賴外界的精氨酸來維持細胞的生長繁殖，而人體正常細胞是能夠自身合成精氨酸的。因此，通過ADI降解血液循環中的精氨酸，精氨酸的營養缺陷導致腫瘤細胞增殖受到抑制，進而達到治療腫瘤的效果。

ADI能有效抑制精氨酸缺陷型腫瘤，如黑素瘤和肝細胞癌(HCC)的增殖。同時，ADI還能誘使人類白血病細胞的凋亡，抑制內皮細胞血管增生。1970年，Gill等人最先報道了從支原體分離得到的ADI能抑制小鼠淋巴瘤L5178Y細胞的分裂（Gill?P,?Pan?J,?1970,16(6):415—419）。小鼠體內研究表明，ADI注射在抑制黑素瘤和HCC實驗鼠中是有效的（Takaku?H,?Takase?M,?1992,51(2):244—249）。然而，ADI用作常規抗腫瘤藥物卻因其低效性而受到限制，而這是由ADI作為一種微生物活性酶，在哺乳動物中具強抑制內皮細胞生長活性和較短的血清半衰期引起的。經20?KD?PEG修飾ADI-PEG-20（ADI-SS?PEG20,00?mw）和天然ADI在體外對黑素瘤和HCC細胞一樣有效。1999年ADI-PEG-20，即PEG化重組支原體ADI被FDA指定為美國罕見病藥物，用于治療惡性黑素瘤和HCC。目前正在全球范圍進行治療黑色素瘤和原發性肝癌的II期和III期臨床試驗。