[發明專利]克倫特羅單克隆抗體的制備及其應用

有效

• 申請號: 201110282182.2
• 申請日: 2011-09-21
• 公開（公告）號: CN103012593A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 何方洋;馮才偉;付軍權;馮才茂;聶雯瑩;楊秀賢;劉福林;段盈盈
• 申請（專利權）人: 北京勤邦生物技術有限公司
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C07C215/68;C07C213/00;G01N33/577
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1.一種克倫特羅單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述克倫特羅單克隆抗體采用合成的克倫特羅半抗原與載體蛋白偶聯得到的抗原進行動物免疫而得到的，克倫特羅半抗原的合成方法包括下述步驟：

(1)1.0-10.0g鹽酸克倫特羅加入到20-100ml二甲基甲酰胺(DMF)中，加入5-25ml三乙胺，10-20％摩爾當量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，0℃下滴加1.1-1.5摩爾當量的叔丁基二甲基氯硅烷在10-50ml?DMF中的溶液，滴加完畢后，室溫繼續反應1-10小時，蒸除大部分溶劑，加水，乙酸乙酯萃取，水洗，干燥，除去溶劑后在環己烷-乙酸乙酯中重結晶得到白色固體，為O-硅烷化克倫特羅；

(2)1.0-5.0g步驟(1)所得產物，加入20-50ml?DMF溶解，加入0.5-1.5g?NaOH，攪拌下滴加1.1-1.5摩爾當量的溴丁酸乙酯在10-20ml?DMF中的溶液，室溫至60℃反應10-20小時。乙酸乙酯萃取，水洗，干燥，除去溶劑后在環己烷-乙酸乙酯中重結晶得到白色固體，為O-硅烷化-N-烷基化克倫特羅；

(3)1.0-3.0g步驟(2)中產物，溶入50-100ml四氫呋喃(THF)中，加入1.5-2.0摩爾當量的氟化四丁基胺(TBAF)，室溫反應10-20小時，蒸除溶劑，乙酸乙酯溶解，水洗，干燥，除去溶劑后在環己烷-乙酸乙酯中重結晶得到白色固體；

(4)0.87-1.74g步驟(3)產物，融入50-100ml?1∶1乙醇/水溶液中，加入0.38-0.76g硼氫化鈉，室溫反應5-10小時后，除去溶劑，異丙醇中重結晶得到粘稠狀物質或者白色無定形固體，為克倫特羅半抗原。

2.根據權利要求1所述的克倫特羅單克隆抗體的制備方法，其特征在于：克倫特羅小分子經過結構改造得到帶有羧基結構的大分子結構物質N-羧丙基克倫特羅，其分子結構如下：

。

3.根據權利要求1所述的克倫特羅單克隆抗體，其特征在于其制備方法包括以下步驟：

(1)將權利要求2所述的克倫特羅半抗原與牛血清白蛋白偶聯得到的免疫原對8-10周齡的Balb/c小鼠進行三次間隔免疫，在第三次免疫后再進行一次加強免疫，激活體內的淋巴細胞，產生克倫特羅特異性抗體。

(2)將產生克倫特羅特異性抗體的Balb/c小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0按8∶1比例進行融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。將陽性細胞采用有限稀釋法進?行亞克隆，得到穩定的能夠分泌克倫特羅單克隆抗體的雜交瘤細胞。

(3)用液體石蠟致敏Balb/c小鼠，將收集得到的雜交瘤細胞株用1640進行清洗，并注射與小鼠的腹腔。采集到的腹水，用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，純化后的腹水放入-20℃環境保存。

4.如權利要求1所述的克倫特羅單克隆抗體制備的克倫特羅酶聯免疫試劑盒，其包括：

(1)包被了克倫特羅抗原的96孔酶標板；

(2)羊抗鼠酶標二抗；

(3)克倫特羅抗體工作液；

(4)克倫特羅標準品溶液；

(5)底物液A液；

(6)底物液B液；

(7)終止液；

(8)洗滌液。

5.根據權利要求4所述酶聯免疫試劑盒，其特征在于所述的羊抗鼠酶標二抗是采用改良過的過碘酸鈉法將所述羊抗鼠二抗與辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶偶聯得到。

6.如權利要求4或5所述的酶聯免疫試劑盒，其特征在于當所述標記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物A液為pH?5.0，含有0.75％過氧化氫脲的0.1mol/L檸檬酸-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，底物顯色液B液為3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺的乙醇水溶液，所述終止液為2mol/L硫酸；當所述標記酶為堿性磷酸酯酶時，底物顯色液為4-硝基酚磷酸鈉鹽緩沖液，終止液為1～2mol/L的氫氧化鈉溶液，所述百分含量為質量百分比。

7.如權利要求4或5所述的酶聯免疫試劑盒，其特征在于所述包被緩沖液為pH為9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，所述封閉液為pH為7.4，含有1％牛血清白蛋白，0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述洗滌液為pH7.4，含有0.05％吐溫-20，0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為質量百分比。