[發明專利]克倫特羅單克隆抗體的制備及其應用

有效

• 申請號: 201110282182.2
• 申請日: 2011-09-21
• 公開（公告）號: CN103012593A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 何方洋;馮才偉;付軍權;馮才茂;聶雯瑩;楊秀賢;劉福林;段盈盈
• 申請（專利權）人: 北京勤邦生物技術有限公司
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C07C215/68;C07C213/00;G01N33/577
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技術領域

本發明屬于生物化學分析技術領域，具體涉及一種克倫特羅單克隆抗體的制備方法以及用途，用于檢測克倫特羅的酶聯免疫檢測試劑盒和膠體金試紙卡，其特別適用于畜禽組織、尿樣、飼料、乳制品等樣品中克倫特羅藥物殘留的檢測。

技術背景

克侖特羅(Clenbuterol，CBL)，學名鹽酸克侖特羅，又名雙氯胺、氯哮素、克喘寧。克侖特羅是一種β-興奮劑，20世紀80年代初，美國一家公司開始將其添加到飼料中，增加瘦肉率。豬食用后能提高生長速度，在代謝過程中促進蛋白質合成，加速脂肪的轉化和分解，提高了豬肉的瘦肉率，因此稱為瘦肉精；它還使豬毛色紅潤光亮，收腹，賣相好；屠宰后，肉色鮮紅，脂肪層極薄，往往是皮貼著瘦肉，瘦肉豐滿。但是肥豬飼喂瘦肉精后，會發生四肢震顫無力、心肌肥大、心力衰竭等毒副作用。人如果攝入量過大或無病攝入該藥，就可能出現副作用或中毒事故，表現為：心動過速、肌肉震顫、心悸、惡心嘔吐、頭暈、神經過敏和外周血管擴張等，特別對高血壓、心臟病、甲亢、前列腺肥大等疾病患者以及妊娠早期和分娩前期婦女危險更大。故我國和其他許多國家現已禁止在飼料中添加使用克倫特羅，《農業部關于下達2011年獸藥監督抽查計劃的通知》(農醫發[2011]1號文件)要求對生產、經營、使用環節中的肉制品進行嚴格的監測抽檢、跟蹤抽檢和定向抽檢。

目前分析檢測克倫特羅的方法主要有儀器檢測法和免疫分析方法，其中儀器檢測方法主要涉及高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)，但是儀器檢測方法所用的儀器幾乎都屬于大型儀器，價格昂貴，樣品前處理過程復雜，需要專業技術人員才可操作儀器，檢測過程耗時長，檢測成本高，不適合現場監控和大量樣品的篩查；免疫分析方法主要包括酶聯免疫吸附檢測方法(ELISA)和免疫膠體金檢測方法，這兩種方法均屬于快速檢測方法，并在食品安全監管的現場大量樣品篩查工作中已經被使用。兩種檢測方法均操作簡單快速、不需大型儀器設備、不需專業技術人員操作即可完成檢測，特別適合于現場大批量樣品抽檢。但是，目前的檢測克倫特羅酶聯免疫檢測試劑盒對檢測克倫特羅特異性不理想，試劑盒的靈敏度不高，穩定性不好，樣品前處理方法繁瑣費時、樣品前處理所用到的試劑大多數為有機試劑，對人體和環境有一定的危害；克倫特羅膠體金試紙卡存在著檢測產品穩定性差，檢測結果不夠準確的缺點。本發明為了解決上述問題，從改造克倫特羅半抗原結構出發，進而優化免疫原和包被原結構，來改善抗體的質量，提高抗體的特異性，增強抗體與抗原的識別能力。

發明內容

本發明的一個目的是針對現有克倫特羅檢測技術的不足，提供了一種克倫特羅單克隆抗體的制備方法，使其具有抗體效價高、特異性強、成本低廉的特點。

本發明的克倫特羅單克隆抗體是通過以下技術方案得以實現的：

1、克倫特羅抗原的制備

(1)、本發明中的克倫特羅半抗原合成步驟為：

a)1.0-10.0g鹽酸克倫特羅加入到20-100ml二甲基甲酰胺(DMF)中，加入5-25ml三乙胺，10-20％摩爾當量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，0℃下滴加1.1-1.5摩爾當量的叔丁基二甲基氯硅烷在10-50ml?DMF中的溶液，滴加完畢后，室溫繼續反應1-10小時，蒸除大部分溶劑，加水，乙酸乙酯萃取，水洗，干燥，除去溶劑后在環己烷-乙酸乙酯中重結晶得到白色固體，為O-硅烷化克倫特羅；(合成路線如圖1a)

b)11.0-5.0g步驟(1)所得產物，加入20-50ml?DMF溶解，加入0.5-1.5g?NaOH，攪拌下滴加1.1-1.5摩爾當量的溴丁酸乙酯在10-20ml?DMF中的溶液，室溫至60℃反應10-20小時。乙酸乙酯萃取，水洗，干燥，除去溶劑后在環己烷-乙酸乙酯中重結晶得到白色固體，為O-硅烷化-N-烷基化克倫特羅；(合成路線如圖1b)

c).0-3.0g步驟(2)中產物，溶入50-100ml四氫呋喃(THF)中，加入1.5-2.0摩爾當量的氟化四丁基胺(TBAF)，室溫反應10-20小時，蒸除溶劑，乙酸乙酯溶解，水洗，干燥，除去溶劑后在環己烷-乙酸乙酯中重結晶得到白色固體；(合成路線如圖1c)

d)0.87-1.74g步驟(3)產物，融入50-100ml?1∶1乙醇/水溶液中，加入0.38-0.76g硼氫化鈉，室溫反應5-10小時后，除去溶劑，異丙醇中重結晶得到粘稠狀物質或者白色無定形固體，為克倫特羅半抗原(合成路線如圖1d)，其分子結構如下：

(2)免疫原的合成