[發(fā)明專利]小球藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110282065.6
• 申請日: 2011-09-22
• 公開（公告）號: CN102337217A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉麗麗;王艷琪
• 申請（專利權(quán)）人: 天津師范大學(xué)
• 主分類號: C12N1/13
• 分類號: C12N1/13;C12N15/63;C12R1/89
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 王小靜

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種小球藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法。它是一種條件溫和，低成本，便捷的，使外源基因安全地進入小球藻細胞的新方法。在生物技術(shù)領(lǐng)域建立小球藻生物反應(yīng)器，對于生產(chǎn)高價值產(chǎn)品，特別是來源緊俏的基因工程產(chǎn)品具有廣泛的應(yīng)用前景。

背景技術(shù)：

橢圓小球藻(Chlorella?ellipsoidea)為綠藻門小球藻屬真核單細胞綠藻，是一種重要的綠色微藻資源。小球藻是一種理想的蛋白質(zhì)資源，被聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)列為二十一世紀人類的綠色營養(yǎng)源健康食品。小球藻具有原核生物的一些特點：體積小、生態(tài)分布廣、易于培養(yǎng)、生長速度快、應(yīng)用價值高。小球藻還含有葉綠素，可利用光能進行光合作用，像植物一樣自養(yǎng)生長，培養(yǎng)成本低廉。同時，作為真核藻類，它又具有真正的細胞核，對于一些需要大量生產(chǎn)而又對原核生物生長不利的物質(zhì)或表達需要翻譯修飾的復(fù)雜蛋白，可利用小球藻生物反應(yīng)器來生產(chǎn)。此外，小球藻不含內(nèi)毒素，因而利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將小球藻改造成新型高效的生物反應(yīng)器，對于生產(chǎn)高價值產(chǎn)品，特別是來源緊俏的產(chǎn)品具有廣泛應(yīng)用前景。

Maruyama認為：在高場強及長時間的脈沖持續(xù)期，小球藻細胞可得到高的通透性，吸納外源DNA的能力較強。Maruyama等以小球藻(C.saccharophila)為受體，采用高壓電擊法，在600-900V電場強度，400ms脈沖持續(xù)時間的條件下，將質(zhì)粒pBI221導(dǎo)入藻細胞，并檢測到了gus基因的瞬間表達(Maruyama?M?et?al.，1994)。王逸云等在5000V脈沖電壓，50ms脈沖持續(xù)時間，脈沖次數(shù)為2¹¹次，循環(huán)次數(shù)為90次的高強度電場力條件下，將質(zhì)粒pBI121/phyAII轉(zhuǎn)入藻細胞(王逸云，2005)。張小宇等在6000-9000V脈沖電壓，20-50ms脈沖持續(xù)時間，脈沖次數(shù)為2¹⁰條件下，將兔防御素基因NP-1轉(zhuǎn)入藻細胞，獲得了穩(wěn)定表達外源蛋白質(zhì)的小球藻生物反應(yīng)器(張小宇，2006)。

以上報道的方法可以將外源基因轉(zhuǎn)入小球藻，但是這些方法均存在著缺點與不足。首先，高強度或長時間持續(xù)脈沖損傷小球藻細胞；其次，實現(xiàn)上述高電壓及長時間脈沖刺激等實驗條件，必需具備價格昂貴的設(shè)備，增加了實驗成本和實驗難度。因此，尋找一種溫和、不需要專門設(shè)備的使外源基因安全地轉(zhuǎn)入小球藻細胞的新方法非常有必要。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于提供了一種新的小球藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法，可以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。本發(fā)明首先獲得了具有高通透性細胞壁的活體小球藻，溫和地導(dǎo)入基因載體及外源基因，使小球藻表達外源基因，建立小球藻生物反應(yīng)器。本發(fā)明是一種溫和不需要專門設(shè)備以及安全的構(gòu)建小球藻生物反應(yīng)器的方法，利用本生物反應(yīng)器成功地產(chǎn)出了gus基因的表達產(chǎn)物。

本發(fā)明提供的小球藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法包括的步驟：

1)預(yù)培養(yǎng)篩選獲得高通透性細胞壁的活體小球藻：

取對數(shù)生長期的小球藻液體培養(yǎng)物，1％接種量至SE培養(yǎng)基中25℃靜置培養(yǎng)，光照條件3000～4000lx，每4h搖動一次，連續(xù)照明，培養(yǎng)3天。4000rpm離心，收集小球藻細胞。25℃靜置條件下，MBBM液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)24h，30℃條件下，用纖維素酶處理小球藻細胞4h，得到纖維素酶酶解的小球藻細胞培養(yǎng)液。

2)小球藻生物反應(yīng)器構(gòu)建：