[發(fā)明專利]小球藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110282065.6
• 申請日: 2011-09-22
• 公開（公告）號: CN102337217A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉麗麗;王艷琪
• 申請（專利權(quán)）人: 天津師范大學(xué)
• 主分類號: C12N1/13
• 分類號: C12N1/13;C12N15/63;C12R1/89
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 王小靜

1.一種小球藻生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟：

1)預(yù)培養(yǎng)篩選獲得高通透性細胞壁的活體小球藻：

取對數(shù)生長期的小球藻液體培養(yǎng)物，1％接種量至pH7的SE液體培養(yǎng)基中，25℃靜置培養(yǎng)，光照條件3000～4000lx，每4h搖動一次，連續(xù)照明，培養(yǎng)3天，4000rpm離心，收集小球藻細胞；25℃靜置條件下，MBBM液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)24h，30℃條件下，用纖維素酶處理小球藻細胞，得到具有高通透性細胞壁的小球藻細胞培養(yǎng)液；

2)小球藻生物反應(yīng)器構(gòu)建：

取步驟1)的小球藻培養(yǎng)液1mL，4000rpm離心5min，棄上清，用0.8mol/L?NaCl和0.05mol/L?CaCl₂混合液1mL重懸細胞，將小球藻濃度調(diào)整到3～8×10⁷個/mL；27℃下，取0.4mL上述藻液至1.5mL離心管中，加入25μL(OD₂₆₀?1.77)攜帶gus基因的質(zhì)粒pSP-Ubi-GUS?DNA{含Zeocin，博萊霉素)抗性基因ble}，靜置15min；再分別加入200μL的PNC溶液，其組成：0.8mol/L?NaCl，0.05mol/L?CaCl₂，40％PEG?4000，靜置30min；4000rpm離心5min，棄去上清液，分別加入1mL?SEC液體培養(yǎng)基和2μL濃度為10mg/mL?Zeocin，混合均勻，分別涂布于含有10ug/mL?Zeocin的SEC固體培養(yǎng)基上，置于25℃培養(yǎng)箱中，光照條件3000～4000lx靜置培養(yǎng)。挑取單藻落于含有10μg/mL?Zeocin的SEC液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)物為小球藻生物反應(yīng)器；

所述的SEC液體培養(yǎng)基的組成：SE培養(yǎng)基中加入0.5mol/L蔗糖

所述的SEC固體培養(yǎng)基的組成：SE培養(yǎng)基中加入1.3％的瓊脂；

3)小球藻生物反應(yīng)器中g(shù)us基因產(chǎn)物的檢測

在無菌條件下，挑取Zeocin抗性的單藻落轉(zhuǎn)接入500μL含有10μg/mL?Zeocin的SEC液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2～3天；8000rpm離心5min，收集藻體沉淀，加入0.1mL固定液固定30min；加入100μL?GUS染液，37℃下過夜染色；觀察藻液變化，呈現(xiàn)出藍色時證明gus基因已被轉(zhuǎn)入小球藻細胞，其表達產(chǎn)物將反應(yīng)底物催化成新生物質(zhì)；所述的固定液組成：95％乙醇∶冰醋酸＝3∶1。

2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的SE液體培養(yǎng)基的組成：0.25g?NaNO₃，0.075g?K₂HPO₄·3H₂O，0.075g?MgSO₄·7H₂O，0.025g?CaCl₂·2H₂O，0.175g?KH₂PO₄，0.025gNaCl，40mL土壤浸提液，0.005g?FeCl₃·6H₂O，1mL?Fe-EDTA，1mL?A5混合液，958mL蒸餾水；Fe-EDTA：1g?Na₂·EDTA，0.081g?FeCl₃·6H₂O，50mL?HCl(0.1N)，50mL蒸餾水；A5混合液：0.286g?H₃BO₃，0.181g?MnCl₂·4H₂O，0.022g?ZnSO₄·7H₂O，0.0079g?CuSO₄·5H₂O，100mL蒸餾水。