[發(fā)明專利]萊克多巴胺單克隆抗體的制備及其應用

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• 申請日: 2011-09-21
• 公開（公告）號: CN103012592A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設計）人: 何方洋;萬宇平;馮靜;扶勝;聶雯瑩;邵小雪;顧蓉蓉;何麗霞
• 申請（專利權）人: 北京勤邦生物技術有限公司
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C07C245/08;G01N33/577;G01N33/543
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技術領域

本發(fā)明屬于生物化學分析技術領域，具體涉及一種萊克多巴胺單克隆抗體的制備方法以及用途，用于檢測萊克多巴胺的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和膠體金試紙卡，其特別適用于畜禽組織、尿樣、飼料、乳制品等樣品中萊克多巴胺藥物殘留的檢測。

技術背景

萊克多巴胺(ractopamine，Rac)屬于β-腎上腺素受體激動劑(簡稱β-激動劑)，國內(nèi)外許多研究者將其作為飼料添加劑，分別對豬、牛、草魚和鼠等動物進行試驗，證明其具有營養(yǎng)重分配作用，該藥物能改變動物的營養(yǎng)代謝，降低胴體脂肪，提高瘦肉率，同時使動物增重，提高飼料使用率。然而β-激動劑在動物體內(nèi)的蓄積性殘留會對食用者的安全構成潛在威脅，常常引起食用者發(fā)生心悸、肌肉震顫、惡心嘔吐、發(fā)熱寒戰(zhàn)等臨床癥狀，特別對心臟病、糖尿病、高血壓等病人危害更大。在歐洲，1986年就頒布了禁用β-激動劑的禁令，1997年我國農(nóng)業(yè)部嚴禁將β-激動劑等藥物作為動物促生長劑使用。然而由于經(jīng)濟利益的驅(qū)使，違法濫用β-激動劑的現(xiàn)象仍非常普遍，各類中毒事件時有發(fā)生。另外由于美國FDA核準Elanco?Animal?Health?Products所制造的萊克多巴胺用作豬的飼料添加劑，這一規(guī)定成為許多非法使用者的借口。為了打擊非法使用違禁藥物，除了健全法律法規(guī)，建立有效的監(jiān)督管理體系外，還需要健全相應的檢測方法。

目前分析檢測萊克多巴胺的方法主要有儀器檢測法和免疫分析方法，其中儀器檢測方法主要涉及高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)，但是儀器檢測方法所用的儀器幾乎都屬于大型儀器，價格昂貴，樣品前處理過程復雜，需要專業(yè)技術人員才可操作儀器，檢測過程耗時長，檢測成本高，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣品的篩查；免疫分析方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附檢測方法(ELISA)和免疫膠體金檢測方法，這兩種方法均屬于快速檢測方法，并在食品安全監(jiān)管的現(xiàn)場大量樣品篩查工作中已經(jīng)被使用。兩種檢測方法均操作簡單快速、不需大型儀器設備、不需專業(yè)技術人員操作即可完成檢測，特別適合于現(xiàn)場大批量樣品抽檢。但是，目前的檢測萊克多巴胺酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對檢測萊克多巴胺特異性不理想，試劑盒的靈敏度不高，穩(wěn)定性不好，樣品前處理方法繁瑣費時；萊克多巴胺膠體金試紙卡存在著檢測產(chǎn)品穩(wěn)定性差，檢測結(jié)果不夠準確的缺點。本發(fā)明為了解決上述問題，從改造萊克多巴胺半抗原結(jié)構出發(fā)，進而優(yōu)化免疫原和包被原結(jié)構，來改善抗體的質(zhì)量，提高抗體的特異性，增強抗體與抗原的識別能力。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是針對現(xiàn)有萊克多巴胺檢測技術的不足，提供了一種萊克多巴胺單克隆抗體的制備方法，使其具有抗體效價高、特異性強、成本低廉的特點。

本發(fā)明的萊克多巴胺單克隆抗體是通過以下技術方案得以實現(xiàn)的：

1、萊克多巴胺抗原的制備

(1)、本發(fā)明中的萊克多巴胺半抗原合成步驟為：

1.1g對苯二胺，溶入150ml?0.2M的HCl水溶液中，0-4℃下滴加0.7g?NaNO2的20ml水溶液，避光反應0.5-1小時，然后緩慢滴加1.1g萊克多巴胺在20ml?0.5mol/L醋酸鈉水溶液中的混合物。避光反應1-3小時。加入適量濃鹽酸酸化，產(chǎn)生沉淀，離心，水洗，乙酸乙酯提取，除去溶劑后得到半抗原，為萊克多巴胺的偶氮衍生物，得率75-80％(如圖1所示)。其分子結(jié)構如下：

(2)免疫原的合成

本發(fā)明所述免疫原為萊克多巴胺半抗原與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)得到。

免疫原具體的合成方法如下：

a)取萊克多巴胺半抗原30mg用1.5ml水溶解；

b)取50％的1，5-戊二醛(GA)10μl加入(1)中，室溫下攪拌反應18h得到溶液I；

c)取BSA?100mg用5.5ml水稀釋后加入溶液I中，得到溶液II；

d)溶液II反應24h后加入24mg?NaBH₄，反應2h得到溶液III；

e)溶液III用三蒸水透析48小時，即得免疫原。

(3)包被原的合成

本發(fā)明所述包被原為萊克多巴胺半抗原與卵清白蛋白(OVA)進行偶聯(lián)得到。

包被原的具體合成方法如下：

a)取萊克多巴胺半抗原30mg用1.5ml水溶解；

b)取50％的GA?10μl加入(1)中，室溫下攪拌反應18h得到溶液I；

c)取OVA30mg用4.5ml水稀釋后加入到溶液I中，得到溶液II；