[發明專利]萊克多巴胺單克隆抗體的制備及其應用

在審

• 申請號: 201110281716.X
• 申請日: 2011-09-21
• 公開（公告）號: CN103012592A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 何方洋;萬宇平;馮靜;扶勝;聶雯瑩;邵小雪;顧蓉蓉;何麗霞
• 申請（專利權）人: 北京勤邦生物技術有限公司
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C07C245/08;G01N33/577;G01N33/543
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1.一種萊克多巴胺單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述萊克多巴胺單克隆抗體采用合成的萊克多巴胺半抗原與載體蛋白偶聯得到的抗原進行動物免疫而得到的，其中所述萊克多巴胺半抗原的制備方法步驟為：1.1g對苯二胺，溶入150ml?0.2M的HCl水溶液中，0-4℃下滴加0.7g?NaNO₂的20ml水溶液，避光反應0.5-1小時，然后緩慢滴加1.1g萊克多巴胺在20ml0.5mol/L醋酸鈉水溶液中的混合物。避光反應1-3小時。加入適量濃鹽酸酸化，產生沉淀，離心，水洗，乙酸乙酯提取，除去溶劑后得到萊克多巴胺半抗原，為萊克多巴胺的偶氮衍生物。

2.根據權利要求1所述的萊克多巴胺單克隆抗體的制備方法，其特征在于：萊克多巴胺小分子經過結構改造得到帶有氨基結構的萊克多巴胺的偶氮衍生物，其分子結構如下：

3.根據權利要求1所述的萊克多巴胺單克隆抗體，其特征在于其制備方法包括以下步驟：

(1)將權利要求2所述的萊克多巴胺半抗原與牛血清白蛋白偶聯得到的免疫原對8-10周齡的Balb/c小鼠進行三次間隔免疫，在第三次免疫后再進行一次加強免疫，激活體內的淋巴細胞，產生萊克多巴胺特異性抗體。

(2)將產生萊克多巴胺特異性抗體的Balb/c小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0按8∶1比例進行融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。將陽性細胞采用有限稀釋法進行亞克隆，得到穩定的能夠分泌萊克多巴胺單克隆抗體的雜交瘤細胞。

(3)用液體石蠟致敏Balb/c小鼠，將收集得到的雜交瘤細胞株用1640進行清洗，并注射與小鼠的腹腔。采集到的腹水，用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，純化后的腹水放入-20℃環境保存。

4.如權利要求1所述的萊克多巴胺單克隆抗體制備的萊克多巴胺酶聯免疫試劑盒，其包括：

(1)包被了萊克多巴胺抗原的96孔酶標板；

(2)羊抗鼠酶標二抗；

(3)萊克多巴胺抗體工作液；

(4)萊克多巴胺標準品溶液；

(5)底物液A液；

(6)底物液B液；

(7)終止液；

(8)2×濃縮洗滌液。

5.根據權利要求4所述酶聯免疫試劑盒，其特征在于所述的羊抗鼠酶標二抗是采用改良過的過碘酸鈉法將所述羊抗鼠二抗與辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶偶聯得到。

6.如權利要求4或5所述的酶聯免疫試劑盒，其特征在于當所述標記酶為辣根過氧化物酶時，所述底物A液為pH?5.0，含有0.75％過氧化氫脲的0.1mol/L檸檬酸-0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，底物顯色液B液為3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺的乙醇水溶液，所述終止液為2mol/L硫酸；當所述標記酶為堿性磷酸酯酶時，底物顯色液為4-硝基酚磷酸鈉鹽緩沖液，終止液為1～2mol/L的氫氧化鈉溶液，所述百分含量為質量百分比。

7.如權利要求4或5所述的酶聯免疫試劑盒，其特征在于所述包被緩沖液為pH為9.4～9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，所述封閉液為pH為7.2，含有1％卵清白蛋白，0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述洗滌液為pH7.2，含有0.05％吐溫-20，0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為質量百分比。

8.如權利要求4或5的酶聯免疫試劑盒，其特征在于萊克多巴胺標準品溶液的濃度分別為0μg/L、0.05μg/L、0.15μg/L、0.45μg/L、1.35μg/L、4.05μg/L。

9.由權利要求3所述的萊克多巴胺單克隆抗體制備的萊克多巴胺膠體金試紙卡，其由樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜和吸水墊依次粘貼在PVC底板上組成，所述結合物釋放墊上包被有膠體金標記的萊克多巴胺單克隆抗體，所述反應膜上有檢測區和質控區，檢測區包被有萊克多巴胺半抗原和載體蛋白偶聯物，質控區包被有羊抗鼠抗抗體。

10.如權利要求9所述的萊克多巴胺膠體金試紙卡，其特征在于萊克多巴胺半抗原和載體蛋白偶聯得到，所述載體蛋白可為甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白。