[發(fā)明專利]表達載體及應(yīng)用微藻產(chǎn)生油脂的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110278884.3
• 申請日: 2011-09-20
• 公開（公告）號: CN102559727A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 簡良榮;謝欣如
• 申請（專利權(quán)）人: 財團法人工業(yè)技術(shù)研究院;明志科技大學(xué)
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N1/13;C12P7/64;C12R1/89
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 陳小雯

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種可在微藻中表達外源基因的表達載體，特別是涉及利用此表達載體提高微藻產(chǎn)油效率的方法。

背景技術(shù)

微藻(microalgae)是一群微型生物的總稱，包括眾多真核和原核種類。微藻可以直接利用太陽能生產(chǎn)高品質(zhì)的蛋白質(zhì)和其它營養(yǎng)物質(zhì)以及特殊生物活性物質(zhì)。實際上微藻廣泛應(yīng)用在食品、飼料、醫(yī)藥等領(lǐng)域，生產(chǎn)例如藻體粉、長鏈不飽和脂肪酸、色素蛋白、或藻多糖等。近年來，隨著原油價格飛漲及使用化石燃料引發(fā)的全球暖化問題，利用微藻制造生物燃料的構(gòu)想也持續(xù)受到全球關(guān)注。

美國專利申請公開號US2010/0167339A1記載提高微藻濃度的條件及步驟，利用固體顆粒激烈攪動微藻，使其破裂，形成微藻漿，以吸收性泡沫分離步驟處理微藻漿，而形成流動性佳的藻體生物質(zhì)，可應(yīng)用于生物燃料中。

鑒于微藻的應(yīng)用前景及高價值化，利用遺傳工程改良微藻細胞中的基因產(chǎn)物，已被廣泛使用。例如美國專利申請US2009/0176272A1記載一種生產(chǎn)生物燃料用的核酸序列的表達，使編碼與形成丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的脂肪酸生物合成相關(guān)的蛋白的基因通過重組質(zhì)粒pDs69r在藻體中表達，提高脂肪酸的產(chǎn)量。

WO2009/073822A2揭示一種提高微藻生產(chǎn)生物燃料的基因及化學(xué)工程策略，通過包含一表達盒、一基因堆棧表達載體及一表達載體的重組藻體所達成，其中該表達盒包括抑制編碼Cao、LHCII-b、DC、PFL1/PFLA或AGP酶的蛋白質(zhì)的代謝基因表達的siRNA分子；該基因堆棧的表達載體包括編碼ACCase、DGAT、caleosin及oleosin多肽的核酸序列；以及該表達載體包括編碼PCC?7942ftp-1基因的核酸序列。

本發(fā)明人等鑒于先前技術(shù)的繁復(fù)操作步驟及產(chǎn)生油脂的效率，根據(jù)微藻的生理特性，設(shè)計新穎的表達載體，通過基因工程重組產(chǎn)油相關(guān)基因，突破野生型微藻無法兼具高光合效率、高二氧化碳固定效率及生長速率的特性，在傳統(tǒng)的微藻培養(yǎng)系統(tǒng)中，提高產(chǎn)油效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個實施方案中，提供一種表達載體，包括一蛋白質(zhì)表達盒以及至少兩個同源重組DNA片段，分別位于該蛋白質(zhì)表達盒的兩側(cè)；其中該蛋白質(zhì)表達盒包括：第一篩選標記；啟動子；多重克隆位點，鄰接于該啟動子的下游；以及第二篩選標記，其中該啟動子包括花椰菜葉病毒(Cauliflower?mosaic?virus；CaMV)35S啟動子、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基(Ribulose?bisphosphate?carboxylase；RBCs)啟動子、腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(adenine?methyltransferase；AMT)啟動子、硝酸鹽還原酶(nitrate?reductase；NR)啟動子或上述組合。

本發(fā)明的另一個實施方案中，提供一種在微藻中表達蛋白質(zhì)的方法，包括：將一外源基因克隆入上述表達載體中；將該具有外源基因的表達載體轉(zhuǎn)化至微藻中，以及表達該外源基因。

本發(fā)明的另一個實施方案中，提供一種應(yīng)用微藻產(chǎn)生油脂的方法，包括提供一種如上述的表達載體；將至少一外源基因插入該多重克隆位點；將該具有至少一外源基因的表達載體轉(zhuǎn)化至微藻中；以及于微藻中表達該至少一外源基因；其中，該外源基因包括編碼與脂質(zhì)生物合成相關(guān)的酶的基因或與前述基因的序列同一性至少為80％的基因。在本發(fā)明的一種具體實施方案中，該外源基因選自下組：編碼甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)的基因(SEQ?ID?NO：1～6)、甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(GPAT)的基因(SEQ?IDNO：7～10)、編碼溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(LPAAT)的基因(SEQ?IDNO：11～12)、編碼磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因(SEQ?ID?NO：13～16)、編碼二酰基甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)的基因(SEQ?ID?NO：17～21)、編碼乙酰基-CoA羧基酶(ACCase)的基因(SEQ?ID?NO：22)、編碼碳酸酐酶(CA)的基因(SEQ?IDNO：23)、以及與前述任一基因的序列同一性至少為80％的核苷酸序列。

定義