[發明專利]表達載體及應用微藻產生油脂的方法

無效

• 申請號: 201110278884.3
• 申請日: 2011-09-20
• 公開（公告）號: CN102559727A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 簡良榮;謝欣如
• 申請（專利權）人: 財團法人工業技術研究院;明志科技大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N1/13;C12P7/64;C12R1/89
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 陳小雯

1.表達載體，包括：

蛋白質表達盒；和

至少兩個同源重組DNA片段，分別位于該蛋白質表達盒兩側；其中該蛋白質表達盒包括：

第一篩選標記；啟動子；多重克隆位點，鄰接于該啟動子下游；以及第二篩選標記，其中該啟動子包括花椰菜葉病毒(CaMV)35S啟動子、1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基(RBCs)啟動子、腺嘌呤甲基轉移酶(AMT)啟動子、硝酸鹽還原酶(NR)啟動子或上述組合。

2.如權利要求1所述的表達載體，其中，該至少兩個同源重組DNA片段包括LB片段(SEQ?ID?NO：24)、RB片段(SEQ?ID?NO：25)、其部份序列、或上述組合。

3.如權利要求1所述的表達載體，其中，該第一篩選標記包括編碼紅色熒光蛋白(DsRed)的基因、編碼增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的基因、或編碼藍色熒光蛋白(BFP)的基因，該第二篩選標記包括編碼遺傳霉素(G418)的基因、編碼博萊霉素(Zeocin)的基因、或編碼潮霉素(Hygromycin)的基因。

4.如權利要求1所述的表達載體，其中，該多重克隆位點包括限制性酶切位點SacI、EcoI、XbaI、SpeI、SmaI、EcoRI、HindIII、AccI、SalI、SciI、ApaI、KpnI、Acc65I、MRrh4273I、MthsI、MXcyI、Mcfr9I、MRsrI、McoRI、MSsoI、MSau3239I、MPaeR7I、MBstVI、PspOMI或上述組合。

5.如權利要求1所述的表達載體，其中，該蛋白質表達盒還包括至少一個外源基因，其插入該多重克隆位點。

6.如權利要求5所述的表達載體，其中，該外源基因包括選自下組的基因：

編碼甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)的基因(SEQ?ID?NO：1～6)、

編碼甘油-3-磷酸酰基轉移酶(GPAT)的基因(SEQ?ID?NO：7～10)、

編碼溶血磷脂酸酰基轉移酶(LPAAT)的基因(SEQ?ID?NO：11～12)、

編碼磷脂酸磷酸酶(PAP)的基因(SEQ?ID?NO：13～16)、

編碼二酰基甘油酰基轉移酶(DGAT)的基因(SEQ?ID?NO：17～21)、

編碼乙酰基-CoA羧基酶(ACCase)的基因(SEQ?ID?NO：22)、

編碼碳酸酐酶(CA)的基因(SEQ?ID?NO：23)、以及

與前述任一基因的序列同一性至少為80％的核苷酸序列。

7.如權利要求1所述的表達載體，其中，該表達載體在微藻中表達。

8.如權利要求7所述的表達載體，其中，該微藻包括小球藻、微星藻、杜氏藻、擬球藻、雨生血紅藻或柵藻。

9.一種在微藻中表達蛋白質的方法，包括：

將一外源基因克隆入如權利要求1-6中任一項的表達載體中；

將該具有外源基因的表達載體轉化至微藻中，以及

表達該外源基因。

10.如權利要求9所述的在微藻中表達蛋白質的方法，其中該轉化步驟是使用電穿孔法。

11.如權利要求9或10所述的在微藻中表達蛋白質的方法，其中，該微藻包括小球藻、微星藻、杜氏藻、擬球藻、雨生血紅藻或柵藻。

12.一種應用微藻產生油脂的方法，包括：

提供一種如權利要求1所述的表達載體；

將至少一外源基因插入該多重克隆位點；

將該具有至少一外源基因的表達載體轉化至微藻中；以及

于微藻中表達該至少一外源基因；

其中，該外源基因包括編碼與脂質生物合成相關的酶的基因或與前述基因的序列同一性至少為80％的基因。