[發(fā)明專利]一種來源于納豆的脂肪酶抑制劑及其制備方法和用途

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110278595.3
• 申請(qǐng)日: 2007-09-29
• 公開（公告）號(hào): CN102579507A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 段震文;郭樹仁;何大林;閆雪秋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京北大維信生物科技有限公司
• 主分類號(hào): A61K35/74
• 分類號(hào): A61K35/74;A61K45/00;A61P3/04
• 代理公司: 北京太兆天元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11108
• 代理人: 張韜

1.一種脂肪酶抑制劑，其特征在于該脂肪酶抑制劑來源于枯草芽孢桿菌屬微生物，尤其是納豆芽孢桿菌。

2.如權(quán)利要求1所述的脂肪酶抑制劑，其特征在于該脂肪酶抑制劑由如下方法制成：將納豆芽孢桿菌，在瓊脂斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30-40℃，培養(yǎng)時(shí)間為16-48小時(shí)；將活化后的納豆芽孢桿菌轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-48小時(shí)；再將上述培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基中的種子液移至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-144小時(shí)，或移至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-144小時(shí)，培養(yǎng)溫度為30-40℃，液體培養(yǎng)pH控制范圍4-9，即可得到含有抑制脂肪酶的活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的培養(yǎng)物；再用已知的提取分離技術(shù)獲取和分離；

對(duì)于固體發(fā)酵，在上述培養(yǎng)物中加入1-5重量倍的50％-95％乙醇，超聲30-90分鐘，濾出提取液，再加入1-3重量倍的50％-95％乙醇，第二次超聲30-90分鐘，濾出提取液，合并兩次乙醇提取液；用60℃-90℃水浴薄膜減壓蒸發(fā)濃縮，將濃縮液用1-4倍體積乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用50℃-90℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀，得含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取濃縮物；

對(duì)于液體發(fā)酵，將上述培養(yǎng)物離心，得離心清液和濕菌體沉淀；離心清液用80℃-100℃水浴薄膜減壓蒸發(fā)濃縮，得濃縮液；將濃縮液用1-3倍體積氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用50℃-90℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮氯仿萃取液，濃縮至膏狀，得含有脂肪酶抑制活性成分的氯仿萃取物；濕菌體沉淀放-10℃--30℃冰箱冷凍15-30小時(shí)，置室溫解凍后加入1-3倍體積倍甲醇，超聲提取2次，每次30-90分鐘；合并兩次提取液，用40℃-70℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的甲醇提取濃縮物。

3.如權(quán)利要求2所述的脂肪酶抑制劑，其特征在于該脂肪酶抑制劑由如下方法制成：將納豆芽孢桿菌，在瓊脂斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，培養(yǎng)溫度37℃±1℃，培養(yǎng)時(shí)間為22-26小時(shí)；將活化后的納豆芽孢桿菌轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24小時(shí)；將上述培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基中的種子液移至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)68-96小時(shí)，或移至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)68-96小時(shí)，培養(yǎng)溫度均為37℃±1℃，液體發(fā)酵pH控制范圍為4.5-8.5，即可得到含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的培養(yǎng)物；再用已知的提取分離技術(shù)獲取和分離；

對(duì)于固體發(fā)酵，在上述培養(yǎng)物中加入2.5重量倍的95％乙醇，超聲60分鐘，濾出提取液，再加入2重量倍的80％乙醇，第二次超聲60分鐘，濾出提取液，合并兩次乙醇提取液；用80℃水浴薄膜減壓蒸發(fā)濃縮，將濃縮液用2-3倍體積乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用70℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至膏狀，得含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取濃縮物；

對(duì)于液體發(fā)酵，將上述培養(yǎng)物離心，得離心清液和濕菌體沉淀；離心清液用80-100℃水浴薄膜減壓蒸發(fā)濃縮，得濃縮液；將濃縮液用2倍體積氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用70℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮氯仿萃取液，濃縮至膏狀，得氯仿萃取物；濕菌體沉淀放-20℃冰箱冷凍24小時(shí)，置室溫解凍后加入2-3體積倍甲醇，超聲提取2次，每次60分鐘；合并兩次提取液，用60℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即納豆脂肪酶抑制素的甲醇提取濃縮物。

4.如權(quán)利要求2或3所述的脂肪酶抑制劑，其特征在于培養(yǎng)基可以包含一種或多種碳源和一種或多種氮源和任選營養(yǎng)無機(jī)鹽和/或微量元素：碳源包括但不限于淀粉、葡萄糖、蔗糖、糊精、糖蜜、甘油，優(yōu)選葡萄糖；氮源包括但不限于大豆、大豆粉、大豆餅粉、花生粉、花生餅粉、酵母提取物、牛肉提取物、蛋白胨、大豆蛋白胨、麥芽提取物、玉米漿，固體培養(yǎng)優(yōu)選大豆，液體培養(yǎng)優(yōu)選大豆蛋白胨；營養(yǎng)無機(jī)鹽包括但不限于磷酸鹽：磷酸氫鈉、磷酸氫鉀、磷酸氫銨、氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硝酸鉀、硫酸銨、碳酸鈣，優(yōu)選磷酸氫鈉、氯化鈣和硫酸鎂。

5.如權(quán)利要求2或3所述的脂肪酶抑制劑，其特征在于提取分離技術(shù)中所使用的乙醇、乙酸乙酯、氯仿、甲醇等溶劑可以用其他水不混溶劑：如乙酸丁酯、二氯甲烷或水可混溶劑：如丙酮、乙腈、正丙醇、正丁醇、異丙醇代替。