[發(fā)明專利]一種利用RAPD快速區(qū)分葡萄品種的方法

無效

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• 申請日: 2011-09-19
• 公開（公告）號: CN102277444A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發(fā)明（設計）人: 房經(jīng)貴;劉崇懷;王晨;上官凌飛;宋長年;吳偉民
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學分子標記領(lǐng)域，具體地說涉及一種利用RAPD快速地區(qū)分葡萄品種的方法。

背景技術(shù)

葡萄不僅栽培歷史悠久，而且分布廣泛。近些年來，隨著我國葡萄產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，大量的優(yōu)良品種應用于葡萄生產(chǎn)中。因此，建立葡萄品種快速可靠的鑒定技術(shù)體系對于苗木早期鑒定、品種權(quán)利保護、生產(chǎn)中品種的區(qū)分等具有重要的實際意義。目前，傳統(tǒng)單一的形態(tài)學品種鑒定方法已經(jīng)難以有效區(qū)分或鑒別眾多的品種；而且，許多葡萄育種親本越來越集中在少數(shù)優(yōu)良品種或品系上，使得所選育的新品種在更多的性狀上更加相似，而難以區(qū)分。如何有效的鑒定科研和生產(chǎn)中品種，就成為一個常常遇到，而又非常重要的問題。迄今尚沒有利用DNA標記進行品種鑒定的快速與高效的措施，也無法形成進行品種鑒定時的依據(jù)與參考。因此，品種鑒定就缺乏目的性，非直觀，同時隨機性太強，工作效率低。為此，開發(fā)快速進行品種鑒定的新措施具有重要意義。

分子標記是隨著分子克隆和重組DNA技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生的一類遺傳標記。近年來，分子標記技術(shù)已被廣泛用于蔬菜作物的種質(zhì)鑒定和指紋分析。由于DNA分析技術(shù)不受環(huán)境、發(fā)育階段、取樣部位的影響，檢出的多態(tài)位點是無限的，結(jié)果具有高度的可靠性，且鑒別力強，重復性高。在常用的RAPD、RFLP、SSR、AFLP等分子標記技術(shù)中，RAPD(Random?Amplified?Polymorphic?DNA，隨機擴增多態(tài)性DNA)發(fā)展歷史長，是應用最早的DNA標記技術(shù)之一，它以快捷、簡便、不易受外界環(huán)境影響以及不需要預知基因組序列的特點與優(yōu)勢，已被廣泛應用于品種的分類研究、種質(zhì)資源的遺傳基礎研究、基因連鎖標記、遺傳圖譜的構(gòu)建等方面。

現(xiàn)有RAPD在蔬菜作物的種質(zhì)鑒定中，多采用計算機軟件繪制數(shù)字化指紋圖譜，并結(jié)合統(tǒng)計學軟件進行聚類分析，但聚類分析的結(jié)果往往無法用于品種鑒別。中國專利“基于基因組RAPD分析的豇豆品種分子鑒定方法”(專利號ZL200510018593.5)公開了基于RAPD區(qū)分并判斷豇豆不同品種的方法，經(jīng)過篩選得到23個引物，采用0-1指紋技術(shù)并構(gòu)建出聚類樹。該專利采用引物較多，在品質(zhì)鑒定時操作量非常大，通過聚類樹不好判斷區(qū)分品種的引物，而且不夠直觀。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種利用RAPD快速區(qū)分葡萄品種的方法，用于高效區(qū)分葡萄品種，構(gòu)建直觀實用的鑒別圖譜。

技術(shù)方案：為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一種利用RAPD快速區(qū)分葡萄品種的方法包括如下步驟：

(1)針對葡萄的基因序列設計RAPD隨機引物，篩選得到穩(wěn)定性和多態(tài)性高的隨機引物，并確定退火溫度；

(2)利用步驟(1)得到的隨機引物對未知葡萄品種進行PCR擴增，根據(jù)特異性譜帶構(gòu)建相應被區(qū)分品種的圖譜關(guān)系。

所述步驟(1)中的隨機引物由11個堿基組成，隨機引物篩選通過連續(xù)兩次梯度PCR選擇條帶一致的溫度作為退火溫度。RAPD中的引物設計非常關(guān)鍵，一般RAPD的引物為9～10個堿基，理論上，引物越短，模板序列兩端與引物互補的位點數(shù)量越多，擴增的PCR多態(tài)性豐富；但是，引物較短，也會引起模板互補配對穩(wěn)定性低的問題。本發(fā)明引物針對植物品種鑒定的特點，采用11個堿基。在引物篩選過程中，選擇擴增性強、穩(wěn)定性高、多態(tài)性好的隨機引物，滿足用于分析基因組多態(tài)性的引物要求。

所述步驟(2)中構(gòu)建圖譜關(guān)系，根據(jù)引物擴增出的譜帶，單獨具有多態(tài)性譜帶的品種被區(qū)別出來，其余品種根據(jù)譜帶表現(xiàn)進行分組，再通過其他引物區(qū)別、分組，直到所有品種被鑒別。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)不同的是未采用“0-1”矩陣構(gòu)建指紋圖譜并進行聚類分析，通過對比譜帶進行篩選，建立直觀的鑒別圖譜。圖譜中的各葡萄品種通過引物擴增后的譜帶表現(xiàn)進行區(qū)別或分組，建立樹形圖，標明相應引物和譜帶。

本發(fā)明采用7個隨機引物即可區(qū)別28個葡萄品種，這28個品種包括：‘高妻’、‘京亞’、‘黑元帥’、‘紅富士’、‘巨玫瑰’、‘高墨’、‘龍寶’、‘夕陽紅’、‘先鋒’、‘黑瑰香’、‘紅伊豆’、‘密紅’、‘紅瑞寶’、‘京超’、‘無核’、‘伊豆錦’、‘無核早紅’、‘美人指’、‘信濃樂’、‘翠峰’、‘蜜汁’、‘矢富羅莎’、‘藤稔’、‘紅地球’、‘巨峰’、‘綠寶石無核’、‘黑奧林’、‘黃意大利’，所述隨機引物及對應退火溫度如下：

S1+C?????5’-GTTTCGCTCCC-3’45.1℃；

S10+A????5’-CTGCTGGGACA-3’43.6℃；

S10+T????5’-CTGCTGGGACT-3’39.3℃；