[發明專利]一種土壤微生物cDNA文庫的構建方法

無效

• 申請號: 201110277886.0
• 申請日: 2011-09-19
• 公開（公告）號: CN102418151A
• 公開（公告）日: 2012-04-18
• 發明（設計）人: 方長旬;林文雄;黃力坤;許鐵城;林瑞余
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/08;C12N1/21;C12N15/70;C12N15/10;C12R1/19
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及一種土壤微生物cDNA文庫的構建方法，屬于生物技術領域。

背景技術

隨著生物及信息技術的迅速發展，挖掘、克隆新基因、研究新基因的功能已成為功能基因組研究中的一項重要工作。構建??cDNA??文庫是功能基因組學研究的基本手段之一，其在研究具體某類特定細胞中基因組的表達狀態及表達基因的功能鑒定方便具有特殊的優勢，從而使它在個體發育、細胞分化、細胞周期調控、細胞衰老和死亡調控等生命現象的研究中具有更為廣泛的應用價值，是研究工作中最常使用到的基因文庫。

土壤微生物作為土壤生態系統的重要組成部分，在土壤有機物質分解和養分釋放、能量轉移等生物地化循環中扮演著重要角色，土壤微生物的功能多樣性也成為土壤生態學研究的熱點問題。構建土壤微生物的cDNA文庫則能夠為深入分析土壤微生物功能多樣性，包括不同環境條件下，土壤微生物中相關基因的表達、調控，以及此過程中的基因與基因、蛋白質與蛋白質的互作提供重要的基礎。然而，由于土壤中的微生物包括細菌、放線菌和真菌等，它們所轉錄的mRNA各不相同，常規的方法需要我們利用特定的試劑盒提取土壤總mRNA，包括帶poly(A)的(真菌和放線菌mRNA、少數細菌的一些mRNA)和不帶poly(A)的(細菌mRNA)。在此基礎上，分別針對這兩種類型的mRNA，應用不同試劑盒分離各種mRNA，最后合并成用于cDNA文庫構建的土壤總mRNA。此法不僅費時費力，而且由于操作過程繁瑣容易出現RNA降解而導致實驗失敗。

????因此，開發一種快速、簡單、高效的土壤微生物cDNA文庫的構建方法，解決常規操作步驟復雜，RNA容易降解的問題，此法對于開展土壤微生物的功能多樣性研究十分必要。鑒于此，發明人前期發明了一種土壤微生物DNA和總RNA的提取方法(申請號：201010548527.X)，通過此法并分離獲得土壤微生物總RNA，本發明在此基礎上，開發一種簡單、高效的土壤cDNA文庫的構建方法。

發明內容

本發明提供一種簡單有效的土壤微生物cDNA文庫的構建方法，利用該法獲得的文庫的容量大。

本發明的土壤微生物cDNA文庫的構建方法，包括土壤微生物總RNA的提取、逆轉錄，5’端接頭連接，3’端接頭連接，PCR擴增，以及cDNA文庫的構建，其特征在于：具體步驟包括如下：

（1）土壤微生物總RNA獲得：提取獲得土壤微生物基因組DNA和總RNA，再利用DNA酶去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA純化后備用；

（2）總RNA的逆轉錄：總RNA采用PrimeScript?RT?reagent?Kit進行逆轉錄，逆轉錄獲得的cDNA用2.5倍體積的無水乙醇和0.1倍體積的3M?、pH=5.2的醋酸鈉溶液，于-20℃下沉淀12?h；

（3）cDNA?5’端接頭連接：純化后的cDNA?用堿性磷酸酶進行5’的去磷酸化反應，去磷酸化的cDNA與5’接頭1進行連接，連接產物用2.5倍體積的無水乙醇和0.1倍體積的的3M、pH=5.2的醋酸鈉溶液，于-20℃下沉淀12h；其中接頭1：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'，5’端經磷酸化修飾；

（4）cDNA?3’端接頭連接：連有5’接頭cDNA的3’端用T4多核苷激酶進行磷酸化反應，磷酸化反應后的cDNA與3’接頭2進行連接；其中接頭2：?5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'；

（5）PCR擴增：分別連接有3’端和5’端接頭的cDNA用接頭的互補引物P1：5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'?，P2：5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'?進行擴增，具體的反應參數為：95℃?1?min，94℃?1?min、65℃?30sec、72℃?2?min?30sec共30?cycles,?72℃?10min，擴增后的產物再以相同的引物進行二次擴增；

（6）cDNA?文庫構建：二次擴增的PCR產物經純化后，與pMD-18?T載體進行連接、轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，獲得cDNA文庫。

步驟（1）中利用DNA酶I去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA用RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒和MicroSpin?S-400?HR?spin?column進行純化。