[發明專利]一種土壤微生物cDNA文庫的構建方法

無效

• 申請號: 201110277886.0
• 申請日: 2011-09-19
• 公開（公告）號: CN102418151A
• 公開（公告）日: 2012-04-18
• 發明（設計）人: 方長旬;林文雄;黃力坤;許鐵城;林瑞余
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/08;C12N1/21;C12N15/70;C12N15/10;C12R1/19
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種土壤微生物cDNA文庫的構建方法，包括土壤微生物總RNA的提取、逆轉錄，5’端接頭連接，3’端接頭連接，PCR擴增，以及cDNA文庫的構建，其特征在于：具體步驟包括如下：

（1）土壤微生物總RNA獲得：提取獲得土壤微生物基因組DNA和總RNA，再利用DNA酶去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA純化后備用；

（2）總RNA的逆轉錄：總RNA采用PrimeScript?RT?reagent?Kit進行逆轉錄，逆轉錄獲得的cDNA用2.5倍體積的無水乙醇和0.1倍體積的3M?、pH=5.2的醋酸鈉溶液，于-20℃下沉淀12?h；

（3）cDNA?5’端接頭連接：純化后的cDNA?用堿性磷酸酶進行5’的去磷酸化反應，去磷酸化的cDNA與5’接頭1進行連接，連接產物用2.5倍體積的無水乙醇和0.1倍體積的的3M、pH=5.2的醋酸鈉溶液，于-20℃下沉淀12h；其中接頭1：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'，5’端經磷酸化修飾；

（4）cDNA?3’端接頭連接：連有5’接頭cDNA的3’端用T4多核苷激酶進行磷酸化反應，磷酸化反應后的cDNA與3’接頭2進行連接；其中接頭2：?5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'；

（5）PCR擴增：分別連接有3’端和5’端接頭的cDNA用接頭的互補引物P1：5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'?，P2：5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'?進行擴增，具體的反應參數為：95℃?1?min，94℃?1?min、65℃?30sec、72℃?2?min?30sec共30?cycles,?72℃?10min，擴增后的產物再以相同的引物進行二次擴增；

（6）cDNA?文庫構建：二次擴增的PCR產物經純化后，與pMD-18?T載體進行連接、轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，獲得cDNA文庫。

2.根據權利要求1所述的土壤微生物cDNA文庫的構建方法，其特征在于：步驟（1）中利用DNA酶I去除基因組DNA后獲得總RNA，總RNA用RNAPure高純總RNA快速提取試劑盒和MicroSpin?S-400?HR?spin?column進行純化。