[發明專利]細菌耐藥基因檢測芯片及其應用

有效

• 申請號: 201110276409.2
• 申請日: 2011-09-19
• 公開（公告）號: CN102321763A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 李越希;潘英;傅雅麗;潘明潔
• 申請（專利權）人: 李越希
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司 32215
• 代理人: 奚勝元

技術領域

本發明涉及的是一種高通量的細菌耐藥基因檢測芯片及其應用。基因芯片的探針選擇包括超廣譜β內酰胺酶、頭孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶類基因、四環素家族耐藥基因、氨基糖甙類藥物耐藥基因、耐消毒劑基因、紅霉素耐藥相關基因、大環內酯類外排基因、耐萬古霉素耐藥基因、多藥耐藥外排泵基因、耐莫匹羅星基因、磺胺類耐藥基因、泰洛星耐藥基因、氟喹諾酮類藥物耐藥基因、氯霉素酰基轉移酶、常用基因工程載體耐藥基因等17大類耐藥基因，共117條基因探針，可用于病原菌耐藥基因的檢測。本發明及應用涉及的技術領域是醫學檢驗和基因芯片技術。

技術背景

近幾十年來，隨著廣譜抗生素的廣泛不合理使用，導致大多數細菌有多重耐藥性，尤其近年來出現了超級細菌，極易引起醫院獲得性感染。據報道，全球60億人口，每年3億人住院，1500萬人患醫院感染，150萬人死于醫院感染。中國內地院內感染發生率約為8%，且漏報率很高，給臨床治療造成很大困難，也構成了嚴重的公共衛生問題。因此對這些病原菌快速檢測確定其耐藥性，不僅在指導臨床合理選用抗菌藥有重要價值，也為預防和控制耐藥細菌感染和傳播提供依據，為耐藥疫情監控和監測檢驗提供了可靠的技術手段，具有重要的現實意義

細菌耐藥性嚴重的現況引起了很多國家的重視，為了預防、控制病原菌的傳播，各國政府都加大投入開發快速有效的診斷方法來檢測、診斷和控制病原菌。目前，一般檢測耐藥性的方法有：藥物敏感試驗、質粒消除試驗、質粒指紋圖譜技術、分子雜交技術，PCR等，但這些檢測方法在臨床上難以及早進行病原學診斷和耐藥性測定，無法滿足臨床救治危重感染者的需要。比如細菌的培養，根據不同的病原菌類型需要從18h到數天不等，對于個別細菌（如結核分枝桿菌）需要更長的時間，甚至需要專門的實驗室生長條件。臨床上細菌耐藥性檢測主要使用藥敏試驗，其優點在于方便、簡捷、易判定，但只能對少量樣品進行一對一檢測分析，也無法反映出細菌耐藥的來源和傳播機制。近年來分子雜交技術和PCR也已經廣泛應用于細菌耐藥性的檢測，彌補了藥敏試驗的不足，分子雜交技術特異性較好，但操作步驟繁瑣，耗時長，而常規PCR技術往往只限制于單一耐藥基因的的檢測，要對細菌眾多的耐藥基因進行檢測需要做大量的工作，甚至難以實現。

基因芯片技術（Gene?chip）于上世紀90年代發展起來，是將多種寡核苷酸分子固定于固相載體上形成DNA微陣列，將樣品核酸用同位素和熒光等方法標記，與芯片探針雜交檢測樣本內的多種特異DNA序列，通過計算機系統分析，迅速得到獲得樣品中大量基因序列特征或基因表達特征信息。

基因芯片為感染性疾病的臨床診斷提供了有力的工具，與傳統檢測方法相比有多種優點：能同時進行高通量分析；無需機體免疫應答反應，能早期檢測診斷；對檢測樣品需要量少，效率高；可用于大規模的病原菌分類鑒定，耐藥性及毒力因子檢測等。因此，基因芯片在醫學領域中已有了廣泛的應用。

多種病原微生物的基因組序列已被闡明，各種各樣的耐藥基因被克隆、測序，為建立細菌耐藥基因檢測芯片奠定了基礎。研制細菌耐藥基因檢測芯片，能為快速確定病原菌的抗藥性、臨床正確選用抗菌藥提供依據，對預防和控制耐藥細菌感染和傳播有重大意義。

發明內容

本發明目的是針對上述不足之處提供一種細菌耐藥基因檢測芯片及其應用，是建立一種檢測17大類耐藥基因的基因芯片，可對病原菌進行高通量快速檢測,?17大類耐藥基因包括超廣譜β內酰胺酶、頭孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶類基因、四環素家族耐藥基因、氨基糖甙類藥物耐藥基因、耐消毒劑基因、紅霉素耐藥相關基因、大環內酯類外排基因、耐萬古霉素耐藥基因、多藥耐藥外排泵基因、耐莫匹羅星基因、磺胺類耐藥基因、泰洛星耐藥基因、氟喹諾酮類藥物耐藥基因、氯霉素酰基轉移酶、常用基因工程載體耐藥基因等。根據NCBI數據庫提供的耐藥基因序列，從17大類耐藥基因中篩選了117條基因探針，用于制備基因芯片，建立基因芯片的檢測及分析方法，并進行應用。該基因芯片可用于含17大類耐藥基因的病原菌檢測、分型、合理用藥、感染病監測及流行病學調查。

一種細菌耐藥基因檢測芯片及其應用是采取以下技術方案實現：

一種細菌耐藥基因檢測芯片包括（1）17大類耐藥基因的117條寡核苷酸探針組合和質量控制探針；（2）寡核苷酸探針通過手臂分子固化在載體材料上形成的探針陣列；

所述的寡核苷酸探針是指化學合成的多種耐藥基因序列的高度保守區的互補寡聚核苷酸，長度為十到五十個堿基；