[發明專利]細菌耐藥基因檢測芯片及其應用

有效

• 申請號: 201110276409.2
• 申請日: 2011-09-19
• 公開（公告）號: CN102321763A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 李越希;潘英;傅雅麗;潘明潔
• 申請（專利權）人: 李越希
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司 32215
• 代理人: 奚勝元

1.一種細菌耐藥基因檢測芯片，其特征在于基因檢測芯片包括（1）17大類耐藥基因的117條寡核苷酸探針組合和質量控制探針；（2）寡核苷酸探針通過手臂分子固化在載體材料上形成的探針陣列；

所述的寡核苷酸探針是指化學合成的多種耐藥基因序列的高度保守區的互補寡聚核苷酸，長度為十到五十個堿基；

所述的細菌耐藥基因檢測芯片是指能檢測17大類耐藥基因的寡核苷酸陣列，17大類耐藥基因包括超廣譜β內酰胺酶、頭孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶類基因、四環素家族耐藥基因、氨基糖甙類藥物耐藥基因、耐消毒劑基因、紅霉素耐藥相關基因、大環內酯類外排基因、耐萬古霉素耐藥基因、多藥耐藥外排泵基因、耐莫匹羅星基因、磺胺類耐藥基因、泰洛星耐藥基因、氟喹諾酮類藥物耐藥基因、氯霉素酰基轉移酶、常用基因工程載體耐藥基因；

所述的質量控制探針至少包括兩種探針，即陽性對照和陰性對照；陰性對照用于檢測雜交信號錯誤或污染，陽性對照用于檢測是否正常雜交的和準確定位；

所述的手臂分子指具有雙活性基團的長鏈有機化合物；

所述寡核苷酸固定為寡聚核苷酸的末端有一特定基團，固化在載體材料基質表面時與表面修飾的手臂分子的末端基團形成共價鍵；

所述的檢測17大類耐藥基因的117條寡核苷酸基因探針如下:

整合酶類基因探針選自Ⅰ類整合酶基因（IntI1）和Ⅱ類整合酶基因（IntI2），每個基因選取正負鏈探針各一條,共4條探針：

intI1基因正鏈探針5'-NH2-T(10)CCAGTGGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTAAACTGTAATGCAAGTAGC-3'

intI1基因負鏈探針5'-NH2-T(10)CTCTACGACGATGATTTACACGCATGTGCTGAAAGTTGGCG-3'

intI2基因正鏈探針5'-NH2-T(10)GGGCATTTAAAGCGATTTTCTGCGTGTTTATGGCTACATGTCTG-3'

intI2基因負鏈探針5'-NH2-T(10)ATGCTTGCGTTTGCGGGTTAAAGATTTTGATTTTGATAATGGCTG-3'

四環素家族耐藥基因探針選擇tetM基因,設計正負鏈探針各一條，Tet(M)是研究得最多的核糖體保護蛋白，具有核糖體依賴的GTP水解酶活性，共2條探針：

tetM基因正鏈探針5'-NH2-T(10)AGTGGGAAAATACGAAGGTGAACATCATAGACACGCCAGGACA-3'

tetM基因負鏈探針5'-NH2-T(10)AAGCGGATCACTATCTGAGATTTCCAAAAGGGCATCAAGCAA-3'

氨基糖甙類藥物耐藥基因探針，選取了易于傳播并且危害較大的氨基糖甙類修飾酶基因有aac(3)-I、aac(3)-II、aac(3)-III、aac(3)-IV、aac?(6')-I、aac(6')-II、aphA6，?ant(3')-I和ant(2'')-I共9種，每個基因選取正負鏈探針各一條,?共18條探針：

aac(3)-I基因正鏈探針5'-NH2-T(10)GGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACGATC-3'

aac(3)-I基因負鏈探針5'-NH2-T(10)GAAAAGATCAAGAGCAGCCCTCATGGATTTGACTTGGTCAGG-3'

aac(3)-II基因正鏈探針5'-NH2-T(10)GTCGAAACTATAGCAAATGCTTACGTGAAGCTCGGTCGCCAT-3'

aac(3)-II基因負鏈探針5'-NH2-T(10)AATCGAGAATGCCGTTTGAATCGTATTCTGATGCCGTTTTCC-3'

aac(3)-III基因正鏈探針5'-NH2-T(10)TGGCTAAACTGGTGGCAATAGAAGGATACGTGCTGATGCTTG-3'

aac(3)-III基因負鏈探針5'-NH2-T(10)CTATCCGTATGACGCTGAGTCACCGAACCGTGATTCAAGC-3'

aac(3)-IV基因正鏈探針5'-NH2-T(10)CTCAAGGAGAAGAGCCTTCAGAAGGAAGGTCCAGTCGGTCAT-3'

aac(3)-IV基因負鏈探針5'-NH2-T(10)GTACCAACTTGCCATCCTGAAGAATGGTGCAGTGTCTCGG-3'

aac?(6')-Ib基因正鏈探針5'-NH2-T(10)ACTTGCTGACGTACAGGAACAGTACTTGCCAAGCGTTTTAGCG-3'

aac?(6')-Ib基因負鏈探針5'-NH2-T(10)ACTGGTCTATTCCGCGTACTCCTGGATCGGTTTCTTCTTCCC-3'

aac?(6')-II基因正鏈探針5'-NH2-T(10)GGTGGGAAGATGAAACTGATCCAGGAGTGCGAGGAATAGACC-3'

aac?(6')-II基因負鏈探針5'-NH2-T(10)GTAGTGTTCCAGCACTTCATCAAGAGTCGGTCGCTCTTCGTC-3'

aphA6基因正鏈探針5'-NH2-T(10)TTGCCCAATATTATTCAACAATTTATCGGAAACAGCGTTTTAGAGCCA-3'

aphA6基因負鏈探針5'-NH2-T(10)CGATTAAAAGAATAAACATCCGATGGCGACTGACCAATTTTATTTGGC-3'

ant(?3')-I基因正鏈探針5'-NH2-T(10)TTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATG-3'

ant(?3')-I基因負鏈探針5'-NH2-T(10)ACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAG-3'

ant(2'')-I基因正鏈探針5'-NH2-T(10)TACAAAGCACATAGAGTCCTACAGGCTCGCATGCACCTCACTC-3'

ant(2'')-I基因負鏈探針5'-NH2-T(10)CATCGGCATAGTAAAAGTAATCCCAGATGATCGCCTCCCAGC-3'

耐消毒劑qacA/B家族基因探針，設計正負鏈探針各一條，共2條探針：

qacA/B基因正鏈探針5'-NH2-T(10)GATTTAGCTCATGTAGCTGAAGAATCTGTAGTGGGCGCTGTCGAA-3'

qacA/B基因負鏈探針5'-NH2-T(10)TGCCATGAAAATTGCTCAAGTAAAGCTCCTCCGATAATTGGTCC-3'

紅霉素耐藥相關基因探針，已發現Erm基因家族有20余種基因亞型，以ErmA，ErmB和ErmC三型為主，每個基因選取正負鏈探針各一條，共6條探針：

ErmA基因正鏈探針5'-NH2-T(10)GATCCCCTACGGCATCACCTCCGCCATCGTCGACTGGT-3'

ErmA基因負鏈探針5'-NH2-T(10)ACCCGTCGAGGAGCTGGAACAGCGTGATCCACTGGTCG-3'

ErmB基因正鏈探針5'-NH2-T(10)TTGAAAGCCATGCGTCTGACATCTATCTGATTGTTGAAGAAGGATTC-3'

ErmB基因負鏈探針5'-NH2-T(10)GCAAGAGCAACCCTAGTGTTCGGTGAATATCCAAGGTACGCTT-3'

ErmC基因正鏈探針5'-NH2-T(10)CGTGGAATACGGGTTTGCTAAAAGATTATTAAATACAAAACGCTCATTG

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ErmC基因負鏈探針5'-NH2-T(10)GGGTAAAATGCCCTTTTCCTGAGCCGATTTCAAAGATATTATCATGTTC-3'

大環內酯類外排（mefA）基因探針，設計正負鏈探針各一條，共2條探針：

mefA基因正鏈探針5'-NH2-T(10)TACCCCAGCACTCAATGCGGTTACACCACTTTTAGTACCAGAAGAA-3'

mefA基因負鏈探針5'-NH2-T(10)TGCAATCACAGCACCCAATACGTCGATGGCAATAATAGCATTTAA-3'

耐萬古霉素耐藥基因探針，選用了由不同的耐藥基因簇編碼的VanA、VanB、VanC1、VanC2、VanD，VanE6種表型，每個基因選取正負鏈探針各一條，共12條探針：

VanA基因正鏈探針5'-NH2-T(10)AAAATCTTAATTGAGCAGGCTGTTTTGGGCTGTGAGGTCGGT-3'

VanA基因負鏈探針5'-NH2-T(10)TACAAATCGCTGAGCTTTGAATATCGCAGCCTACAAAGGGGA-3'

VanB基因正鏈探針5'-NH2-T(10)ACGGAAGAACTTAACGCTGCGATAGAAGCGGCAGGACAATAT-3'

VanB基因負鏈探針5'-NH2-T(10)CCGTATCAATGTTCGCAGCAATTTCTATTGCGGATTTTACCGA-3'

VanC1基因正鏈探針5'-NH2-T(10)CTTGAACTAATGAACCTGCCTTATGTTGGTTGCCATGTCGCTG-3'

VanC1基因負鏈探針5'-NH2-T(10)CACAGTAGAACCGTAAGCAAAAGCAGTCGTTAATGCAGATTGGAGC-3'

VanC2基因正鏈探針5'-NH2-T(10)AAATCAATACTATGCCGGGCTTTACGAGTCACTCCCGCTATCC-3'

VanC2基因負鏈探針5'-NH2-T(10)CGTCTACTAATGAAATGGCGTCACAAGCACCGACAGTCAAAGA-3'

VanD基因正鏈探針5'-NH2-T(10)AGGAACATGATGTTTCAGTGAAATCTGCGATGGAGGTTGCA-3'

VanD基因負鏈探針5'-NH2-T(10)ATGCGTGGATAACGGCTATAGGAAGTAAATCCAGGCATGGTGTTC-3'

VanE基因正鏈探針5'-NH2-T(10)CATGGAGGTTATGGTGAGAATGGTGCTATGCAGGGAGTATTTGAG-3'

VanE基因負鏈探針5'-NH2-T(10)TGTCGTTCCTTCAAATAGATACCAATGACCTTCTTCGGTGATCCCTA-3'

多藥耐藥外排泵基因探針，選擇包括AcrAB-?TolC，OprM和Sme?DEF外排泵基因，每個基因選取正負鏈探針各一條，共6條探針：

AcrAB-TolC基因正鏈探針5'-NH2-T(10)GCAGAAGTTCGTCCTCAAGTTAGCGGGATTATCCTGAAGCGT-3'

AcrAB-TolC基因負鏈探針5'-NH2-T(10)TTCAGCAGGATTTTGCCGAACTCTTCAGTAGAGGTCAGACGC-3'

OprM基因正鏈探針5'-NH2-T(10)CCAAAAGAGGGCGGGATAGGCTAGAGCCCCTATAGCACTAGG-3'

OprM基因負鏈探針5'-NH2-T(10)GTAGCTGCGCTGGGTCAGGTCGAAACTCTTCTGGTAGGTG-3'

Sme?DEF基因正鏈探針5'-NH2-T(10)AGTACCGATGGAAGTGATCCCCATGAAAAGTGCATCCCTGTT-3'

Sme?DEF基因負鏈探針5'-NH2-T(10)GTTGGACGAGCTGTTGGAGGAGAAGTAGATCAGGCCATCAAG-3'

耐莫匹羅星（ileS）基因探針，設計正負鏈探針各一條，共2條探針：

ileS基因正鏈探針5'-NH2-T(10)GAGCCGATTCTTTAAGATGGGCCTTAATTTCGGATAGTGCTCCA-3'

ileS基因負鏈探針5'-NH2-T(10)TTTCTGGTTATCAAAAGGATAATGATGCTGAGCAAACGGCATAGAGC-3'

磺胺類耐藥基因探針，選擇了dfrA和dfrD兩型，每個基因選取正負鏈探針各一條，共4條探針：

dfrA基因正鏈探針5'-NH2-T(10)GGAAACCATTGCCAAATAGACGTAACGTCGTTCTCACTAACCAAGCT-3'

dfrA基因負鏈探針5'-NH2-T(10)CGTCCCATTACAAGTGTATTCCCAGTGGTCAGTTGTTTAACATGCTTT-3'

dfrD基因正鏈探針5'-NH2-T(10)TTGTTGCGATGGATAAGAAAAGAGTAATCGGCAAGGATAACGACATTC-3'

dfrD基因負鏈探針5'-NH2-T(10)CCCTTCCGATTGATTGAAGGTTCTTTCTACCTAATATGATTGCATGTCCT-3'

泰洛星（tlrB）耐藥基因探針，設計正負鏈探針各一條，共2條探針：

tlrB基因正鏈探針5'-NH2-T(10)CTACGGTCATGCGGAAGAACGTCGTGCGATATCTGCGCTGTC-3'

tlrB基因負鏈探針5'-NH2-T(10)AGCTTCGTCGGGCGTCTGAGCAGATTCACATAGCCCTGCC-3'

氟喹諾酮類（norA）藥物耐藥基因探針，norA基因介導的耐藥在金葡菌中相當常見，設計正負鏈探針各一條，共2條探針：

norA基因正鏈探針5'-NH2-T(10)TCCTCACAAAGCAACTACTGATGGATTCCACCAATATCAACCTGAA-3'

norA基因負鏈探針5'-NH2-T(10)TCGTCCAATAACCGTTTGCAAGCACTAACATAACGAGAACAATGG-3'

β內酰胺酶類（BLA）耐藥基因探針，劃分為超廣譜β內酰胺酶、頭胞菌素酶、碳青霉烯酶、金黃色葡萄球菌（MRSA）金標準mecA基因；

其中超廣譜β內酰胺酶（ESBLs）耐藥基因，按不同編碼基因同源性分為TEM型、SHV型、CTX-M型（由于各亞型間CDS核酸基因序列差異較大，根據其序列的同源性分3組），PER型和VEB型，每個基因選取正負鏈探針各一條，共14條探針：

TEM基因正鏈探針5'-NH2-T(10)TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAA-3'

TEM基因負鏈探針5'-NH2-T(10)GCGTCAACACGGGATAATACCGCACCACATAGCAGAACTTTAA-3'

SHV基因正鏈探針5'-NH2-T(10)TAACAAAGCAGAGCGCATCGTGGTGATTTATCTGCGGGATA-3'

SHV基因負鏈探針5'-NH2-T(10)AGTAGTCCACCAGATCCTGCTGGCGATAGTGGATCTTTCGC-3'

CTX-M1基因正鏈探針5'-NH2-T(10)ATGAGACGTTTCGTCTGGATCGCACTGAACCTACGCTGAATA-3'

CTX-M1基因負鏈探針5'-NH2-T(10)CCGCCATAACTTTACTGGTACTGCACATTGGAAAGCGTTCATC-3'

CTX-M2基因正鏈探針5'-NH2-T(10)AAGAAGAGCGACCTGGTTAACTACAATCCCATTGCGGAGAAACA-3'

CTX-M2基因負鏈探針5'-NH2-T(10)CCCAGATGGGCAATCAGCTTATTCATGGCAGTATTGTCGCTAT-3'

CTX-M3基因正鏈探針5'-NH2-T(10)GCGGTGCTGAAGAAAAGTGAAAGCGAACCGAATCTGTTAAATC-3'

CTX-M3基因負鏈探針5'-NH2-T(10)CGTGAGCAATCAGCTTATTCATCGCCACGTTATCGCTGTACT-3'

PER基因正鏈探針5'-NH2-T(10)CGGCCACTAATGATTTAGGTATCATTCTGTTGCCTGATGGACG-3'

PER基因負鏈探針5'-NH2-T(10)GCACTGGAACACTAAACTCGTCTCCCTGATACGCTTTCATTATCGG-3'

VEB基因正鏈探針5'-NH2-T(10)AGATTACCCCTCAAGACCTTTTGCCTAAAACGTGGAGTCCGATTAAA-3'

VEB基因負鏈探針5'-NH2-T(10)TTTGATATTGGGTATTCCAATCCTTGTGCATTTGTTCTTCGTTTGCT-3'

頭孢菌素酶（AmpC）耐藥基因探針分為6組，幾乎涵蓋了所有的質粒AmpC基因序列，設計正負鏈探針各六條，共12條探針：

AmpC基因正鏈探針第一條5'-NH2-T(10)AGCATCCAGCCGCTGCTCAAGGAGCACAGGATC-3'

AmpC基因負鏈探針第一條5'-NH2-T(10)GCCTGCTTCGGCACATTGACATAGGTGTGGTGCAT-3'

AmpC基因正鏈探針第二條5'-NH2-T(10)CCAGAACTGACAGGCAAAAAGTGGCAGGGTATCCGC-3'

AmpC基因負鏈探針第二條5'-NH2-T(10)GTTTTCTCCTGAACGTGGCTGGCATCCATGTTGGC-3'

AmpC基因正鏈探針第三條5'-NH2-T(10)CTTTCACAGGTGTGCTGGGTGCGGTTTCTGTGGC-3'

AmpC基因負鏈探針第三條5'-NH2-T(10)GTACGCATACTGGCTTTGCGCACTTTCCGGCACAGTAATAAA-3'

AmpC基因正鏈探針第四條5'-NH2-T(10)TATGGGTTAGCGGCAAAACAGCCTCAGCAGCCGGTTA-3'

AmpC基因負鏈探針第四條5'-NH2-T(10)AGACTTTTCGCCGCAATCATCCCTAGCAAACCAGTACCGATA-3'

AmpC基因正鏈探針第五條5'-NH2-T(10)CGCTTTTATCAAAACTGGCAGCCGCAGTGGAAGCC-3'

AmpC基因負鏈探針第五條5'-NH2-T(10)CGAGCTGCTTTTCAGGAATAAATGCCACGTAGCTGCCAAAC-3'

AmpC基因正鏈探針第六條5'-NH2-T(10)CATGGCGAACTATGCCTACGGCTATTCGAAGGAAGATAAGCC-3'

AmpC基因負鏈探針第六條5'-NH2-T(10)AACCCCATAGTTGAAATAGTGGGCCTTGCCATCTTTCAGCAC-3'

碳青霉烯酶耐藥基因探針，選取了常見的基因型IMP1型及通用型、OXA23型、OXA24型，VIM型和GES2型，每個基因選取正負鏈探針各一條，共11條探針：

IMP基因通用正鏈探針5'-NH2-T(10)CACTCCATTTACGGCTAAAGATACTGAAAAGTTAGTCACTTGGTTTG

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IMP1基因正鏈探針5'-NH2-T(10)CATTTTCATAGCGACAGCACGGGCGGAATAGAGTGGCTTAAT-3'

IMP1基因負鏈探針5'-NH2-T(10)CCGCCTGCTCTAATGTAAGTTTCAAGAGTGATGCGTCTCCAAC-3'

OXA23基因正鏈探針5'-NH2-T(10)TTAAAATGTTGAATGCCCTGATCGGATTGGAGAACCAGAAAGC-3'

OXA23基因負鏈探針5'-NH2-T(10)TGATGAATCACCTGATTATGTCCTTGAACAATCTGACTCGGGGTTT-3'

OXA24基因正鏈探針5'-NH2-T(10)AATGGGTGTTACTCCACAGGTAGGTTGGTTGACTGGTTGGGT-3'

OXA24基因負鏈探針5'-NH2-T(10)GCTGACAATGCCATTGCCTCACCTAAAGTCATATCTTTCTCCCAC-3'

VIM基因正鏈探針5'-NH2-T(10)GTGATGGTGATGAGTTGCTTTTGATTGATACAGCGTGGGGTG-3'

VIM基因負鏈探針5'-NH2-T(10)GTTGCGATATGCGACCAAACACCATCAGCAATCTGGTAAAGC-3'

GES2基因正鏈探針5'-NH2-T(10)CTGCGGTGCAGCTTAGCGACAATGGGGCTACTAACCTCTTAC-3'

GES2基因負鏈探針5'-NH2-T(10)CCGCCATAGAGGACTTTAGCCACAGTACGTGCCATAGCAATAGG-3'

MRSA金標準mecA基因探針，選取正負鏈探針各一條，共2條探針：

mecA基因正鏈探針5'-NH2-T(10)GAACTCAAAATGAAACAAGGAGAAACTGGCAGACAAATTGGGTGG-3'

mecA基因負鏈探針5'-NH2-T(10)TGGTCTTTCTGCATTCCTGGAATAATGACGCTATGATCCCAATCTAACT-3'

常用基因工程載體耐藥基因探針，包括氯霉素酰基轉移酶（Cat）基因、博萊霉素（?Zeocin?）基因、殺稻瘟菌素（Bsr）基因、嘌呤霉素（Puromycin）基因、卡那霉素（Kana）基因，氨芐霉素（Amp）基因和四環素（Tet）基因，每個基因選取正負鏈探針至少各一條，共16條探針：

Cat基因正鏈探針5'-NH2-T(10)CCTTGCAGCTTCATCATGCTGTATGTGATGGTTACCATGCTTC-3'

Cat基因負鏈探針5'-NH2-T(10)CCAAGGAATCATTGAAATCGGTAGGGTGTTTTCAGGTATCGGTTT-3'

Zeocin基因正鏈探針5'-NH2-T(10)GAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTT-3'

Zeocin基因負鏈探針5'-NH2-T(10)TCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTG-3'

Bsr基因正鏈探針5'-NH2-T(10)CCATTCATCTCAATGAGCACAAAGCAGTCAGGAGCATAGTCAGA-3'

Bsr基因負鏈探針5'-NH2-T(10)AGGTCGCCACTGAGAAGATCACCATGCTCTATGAGGACAACA-3'

Puromycin基因正鏈探針5'-NH2-T(10)GCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCT-3'

Puromycin基因負鏈探針5'-NH2-T(10)GGTGACGGTGAAGCCGAGCCGCTCGTAGAAGGGGAGGTT-3'

Kana基因正鏈探針5'-NH2-T(10)GAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAG-3'

Kana基因負鏈探針5'-NH2-T(10)CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTAT-3'

Tet基因正鏈探針5'-NH2-T(10)CACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGG-3'

Tet基因負鏈探針5'-NH2-T(10)CGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGA-3'

Amp基因正鏈探針第一條5'-NH2-T(10)CACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGA-3'

Amp基因負鏈探針第一條5'-NH2-T(10)CGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTA-3'

Amp基因正鏈探針第二條5'-NH2-T(10)GCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCC-3'

Amp基因負鏈探針第二條5'-NH2-T(10)CGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT-3'。