[發明專利]家蠶中腸特異表達啟動子P3及其應用

有效

• 申請號: 201110273394.4
• 申請日: 2011-09-15
• 公開（公告）號: CN102296071A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發明（設計）人: 夏慶友;蔣亮;程廷才;陸改;金盛凱;王根洪;徐漢福
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/63;C12N15/66;C12N15/85
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及基因工程領域，特別涉及家蠶中腸特異表達啟動子，還涉及含有該啟動子的轉基因載體及該轉基因載體的應用。

背景技術

家蠶是重要的經濟昆蟲和鱗翅目模式生物。家蠶基因組框架圖和精細圖譜的繪制工作相繼在2004和2008完成，標志著人類對家蠶的研究和認識正式進入后基因組時代。對家蠶基因的研究主要采取?“發現基因，研究基因，利用基因”?的策略，目前發現了大量功能未知的家蠶基因，但是對家蠶基因研究進展卻十分緩慢，進一步限制了利用家蠶基因。轉基因和RNA干擾（RNAi）技術是目前研究基因功能最有效的方法，由于家蠶物種本身的特點，在利用RNAi技術研究基因功能方面存在局限，所以轉基因技術是研究家蠶基因功能最有效的手段。但是許多功能基因都為組織特異性表達，因此利用轉基因技術研究組織特異表達基因需要由組織特異啟動子啟動。目前家蠶組織特異表達啟動子較單一，只有定位于絲腺和脂肪體表達的組織特異啟動子報道，導致家蠶轉基因載體中組織特異啟動子缺乏，因此限制了對家蠶組織特異表達基因的研究。

研究表明家蠶的許多重要基因都特異表達于中腸。但是，中腸組織特異的啟動子未見報道，這使科研人員在通過轉基因等技術手段研究中腸組織特異表達基因時感覺很棘手，使相關研究很難開展，同時增加了利用中腸組織特異表達基因的難度。

因此急需一種家蠶中腸啟動子，構建含有家蠶中腸啟動子P3的表達載體，為家蠶轉基因提供中腸組織特異表達載體。

發明內容

有鑒于此，本發明目的之一在于提供一種啟動子，該啟動子在家蠶中腸特異性啟動。

為實現上述技術目的，本發明的技術方案為：

家蠶中腸特異表達啟動子P3，所述家蠶中腸特異表達啟動子P3含有如SEQ?ID?No:2所示核苷酸序列，所述家蠶中腸特異表達啟動子P3的堿基長度不超過2073，源于家蠶BGIBMGA008060基因。

進一步，所述家蠶中腸特異表達啟動子P3的核苷酸序列如SEQ?ID?No:1所示。

進一步，所述家蠶中腸特異表達啟動子P3的核苷酸序列如SEQ?ID?No:2所示的核苷酸序列。

本發明目的之二在于提供家蠶中腸特異性啟動子的制備方法，該方法操作簡單，重現性好。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

所述家蠶中腸特異表達啟動子P3的制備方法，具體步驟如下：以家蠶基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得家蠶中腸特異表達啟動子P3，所述左、右引物分別如SEQ?ID?No:3和SEQ?ID?No:4所示，PCR擴增條件為：94℃預變性4分鐘，94℃變性40秒、49℃退火40秒、72℃延伸2分鐘，共30個循環，最后72℃延伸10分鐘。

本發明目的之三在于提供一種重組載體，其能在家蠶中腸特異表達。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

家蠶中腸特異表達啟動子P3的重組載體。

進一步，根據權利要求5所述家蠶中腸特異表達啟動子P3的重組載體，所述重組載體為P3-EGFP-SV40片段同基礎載體pBac[3×P3-DsRed?af]片段連接而得重組載體pBac[P3-EGFP-SV40-3×P3-DsRed?af]。

本發明目的之四在于提供所述家蠶中腸特異性啟動子的重組載體的構建方法，?該方法操作簡單，穩定性好。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

所述重組載體的構建方法，所述P3-EGFP-SV40片段的構建，具體步驟如下：酶切所述如SEQ?ID?No:1或如SEQ?ID?No:2所示的核苷酸序列，連接用相同內切酶酶切的EGFP-SV40-1180載體，所述EGFP-SV40-1180載體由已含有SV40片段的pSLfa1180fa與pBac[3×P3-EGFP?afm]中EGFP綠色熒光蛋白構建，得中間載體P3-EGFP-SV40-1180，所得中間載體P3-EGFP-SV40-1180用限制性內切酶AscⅠ酶切，得P3-EGFP-SV40片段。