[發(fā)明專利]多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110271336.8
• 申請日: 2011-09-14
• 公開（公告）號: CN102286631A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭書林;陳信忠;龔艷清;孔繁德;楊俊萍;陳垚;徐淑菲;葉妍妍
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 廈門市新華專利商標代理有限公司 35203
• 代理人: 李寧

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法。

背景技術(shù)

目前國際上公認的李斯特菌共有6種：單核細胞增生李斯特菌（Listeria?monocytogenes，簡稱單增李斯特菌）、綿羊李斯特菌(Listeria?ivanovii)、英諾克李斯特菌(Listeria?innocua)、威爾李斯特菌(Listeria?welshimeri)、格氏李斯特菌(Listeria?grayi)和西爾李斯特菌(Listeria?seeligcri)。其中單增李斯特菌是一種人畜共患的病原菌，可引起嚴重的傳染病，如敗血癥、腦炎、腦膜炎。該菌廣泛存在于自然界中，肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都已被證實是單增李斯特菌的感染源，食品中存在的單增李斯特菌對人類的安全具有威脅，該菌在4?℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原之一，2000年被WHO食品安全工作計劃列為檢測的食源性致病菌之一；綿羊李斯特菌主要危害動物，特別是反芻獸，常表現(xiàn)為敗血癥和流產(chǎn)，對人危害較少；英諾克李斯特菌在近期國內(nèi)外報道存在食品中，對人類具有一定的潛在致病性。尤其在發(fā)生由非溶血性變?yōu)槿苎缘淖儺悤r，有致病的潛力；其余3種李斯特菌對人和動物的危害相對較小。英諾克李斯特菌、威爾李斯特菌、格氏李斯特菌等李斯特菌雖不是常規(guī)致病菌，但由于其常與致病的李斯特菌共同存在于食品中，因此也被作為致病李斯特菌的指示菌。在食品中，雖然不同李斯特菌的危害嚴重性不同，但任何一種李斯特菌的存在，均被認為是衛(wèi)生狀況不良的指示。

從上世紀80年代起，美國、日本、新西蘭、德國、英國、法國、歐洲等國家多次因食品污染爆發(fā)人類李斯特菌病。至2003年，我國有報道的散發(fā)性李斯特菌病例150例，死亡率26%。2008年，加拿大共發(fā)生57起李斯特菌感染，造成23人死亡。

目前，鑒定李斯特菌的方法主要分為兩類：一類是傳統(tǒng)的生化鑒定方法，包括微量生化反應(yīng)方法和血清學方法等。另一類是分子生物學方法，包括普通PCR方法和實時熒光PCR方法等。傳統(tǒng)方法費時、費力，且實驗重復(fù)性相對較低，但其準確性使很多國家在制定標準時依然采用傳統(tǒng)方法。分子生物學方法鑒定細菌具備快速、簡便的特點，但在準確性和特異性方面尚有需要改進之處。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供了一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法；本發(fā)明是一種快速、準確、靈敏的多重PCR檢測和鑒定5種李斯特菌的方法，為分子生物學方法鑒定李斯特菌種提供選擇。不僅提高效率，節(jié)約時間，而且節(jié)省檢測成本。

為了達成上述目的，本發(fā)明的解決方案是：

一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法，包括如下步驟：1）首先選擇5條上游引物和1條下游引物；2）取陽性對照標準菌液和待檢菌液分別制備基因組DNA模板；3）分別在陽性對照標準菌液制備的基因組DNA模板和待檢菌液制備的基因組DNA模板中添加所述上游引物和下游引物進行PCR擴增反應(yīng)；4）取擴增后的產(chǎn)物5?μL點樣于1%瓊脂糖凝膠，其中含0.5?μg/mL溴化乙錠，以2000?bp?Marker為標準分子參照，進行電泳；電泳結(jié)果用紫外凝膠成像系統(tǒng)分析；5）結(jié)果判定，待檢樣品與陽性對照同時擴增出230～250?bp條帶的，判定為格氏李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出650～660?bp條帶的，判定為單增李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出460～470?bp條帶的，判定為威爾李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出360～370?bp條帶的，判定為綿羊李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出860～870?bp條帶的，判定為英諾克李斯特菌陽性。

所述的5條上游引物和1條下游引物的引物序列分別為：

上游引物MonoA：5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3；

上游引物Ino2：5'-ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3'；

上游引物WelD：5'-ACAGTAATACAACTGCACCAA-3'；

上游引物Gra1：5'-AATCAAGTAGGTCTTAGCCTTTCTG-3'；

上游引物IvaA：5'-TAGCAGCACGGCAAGCGCAA-3'；

下游引物lis1B：5'-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3'。