[發明專利]多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法

無效

• 申請號: 201110271336.8
• 申請日: 2011-09-14
• 公開（公告）號: CN102286631A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 郭書林;陳信忠;龔艷清;孔繁德;楊俊萍;陳垚;徐淑菲;葉妍妍
• 申請（專利權）人: 廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 廈門市新華專利商標代理有限公司 35203
• 代理人: 李寧

1.一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法，其特征在于包括如下步驟：1）首先選擇5條上游引物和1條下游引物；2）取陽性對照標準菌液和待檢菌液分別制備基因組DNA模板；3）分別在陽性對照標準菌液制備的基因組DNA模板和待檢菌液制備的基因組DNA模板中添加所述上游引物和下游引物進行PCR擴增反應；4）取擴增后的產物5?μL點樣于1%瓊脂糖凝膠，其中含0.5?μg/mL溴化乙錠，以2000?bp?Marker為標準分子參照，進行電泳；電泳結果用紫外凝膠成像系統分析；5）結果判定，待檢樣品與陽性對照同時擴增出230～250?bp條帶的，判定為格氏李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出650～660?bp條帶的，判定為單增李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出460～470?bp條帶的，判定為威爾李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出360～370?bp條帶的，判定為綿羊李斯特菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴增出860～870?bp條帶的，判定為英諾克李斯特菌陽性。

2.如權利要求1所述的一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法，其特征在于：所述的5條上游引物和1條下游引物的引物序列分別為：

上游引物MonoA：5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3；

上游引物Ino2：5'-ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3'；

上游引物WelD：5'-ACAGTAATACAACTGCACCAA-3'；

上游引物Gra1：5'-AATCAAGTAGGTCTTAGCCTTTCTG-3'；

上游引物IvaA：5'-TAGCAGCACGGCAAGCGCAA-3'；

下游引物lis1B：5'-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3'。

3.如權利要求1所述的一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法，其特征在于所述的PCR反應條件如下：95?℃變性3?min；95?℃15?s、58?℃30?s、72?℃45?s，進行30個循環擴增；72?℃延伸5?min。

4.如權利要求3所述的一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法，其特征在于所述PCR反應體系如下：

10×擴增緩沖液?　?????????5?μl；

　?4種dNTP混合物?　??各200?μmol/L?；???　

???引物?　　　　?　???各0.5?μmol/L；　

?DNA模板　　　?　???????2?μg；　??　

?Taq?DNA聚合酶?　????????2u；　???　?

MgCl₂　　　　　???????1.5?mmol/L；?加雙蒸水至?　???????????50?μl；

其中所述的4種dNTP混合物指：三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸dATP，脫氧胸苷三磷酸dTTP，脫氧鳥苷三磷酸三鈉dGTP?，脫氧胞苷三磷酸dCTP。

5.如權利要求4所述的一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法，其特征在于所述的擴增緩沖液配方為：pH?8.8，25℃，100?mM?Tris-HCl；500?mM，?KCl；0.8%(v/v)，乙基苯基聚乙二醇。

6.???如權利要求1所述的一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法，其特征在于所述的陽性對照標準菌液和待檢菌液分別制備基因組DNA模板的方法為：取5種李斯特菌的標準菌株細菌培養液1?ml或者是待檢菌液1?ml，置于無菌的1.5?ml?Eppendorf離心管中，12000?rpm離心1?min，去上清，用滅菌蒸餾水洗滌兩次，收集菌體；加入400?μl裂解液混勻，置于37?℃水浴1?h；然后加入200?μl?5?mol/L的氯化鈉溶液，混勻后于13000?rpm離心15?min；取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；加兩倍體積無水乙醇，1/10體積，3??mol/L?，pH8.0的醋酸鉀，-20?℃保存1?h后，13000?rpm離心15?min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50?μl?TE溶液（上海索萊寶生物科技有限公司）中，置4?℃保存備用。

7.如權利要求6所述的一種多重PCR快速檢測和鑒定五種李斯特菌的方法，其特征在于所述的裂解液配方為：40?mmol/L?Tris-醋酸，20?mmol/L醋酸鈉，1?mmol/L?EDTA，1%十二烷基硫酸鈉（SDS），pH7.8。