[發明專利]一種體外大量擴增細胞系以及間充質干細胞的方法

有效

• 申請號: 201110268612.5
• 申請日: 2011-09-13
• 公開（公告）號: CN102321566A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 黃家學;陳曉波;韓洪起;侯士芳;張宇光;韓俊領;陳勇
• 申請（專利權）人: 協和干細胞基因工程有限公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;C12N5/0775
• 代理公司: 天津才智專利商標代理有限公司 12108
• 代理人: 王曉紅

1.一種體外大量擴增細胞系以及間充質干細胞的方法，其特征在于，應用微載體結合Hyperflask細胞培養容器在體外大量擴增細胞系以及間充質干細胞。

2.根據權利要求1所述的體外大量擴增細胞系以及間充質干細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)微載體的預處理：適合于細胞表面貼壁生長的微載體以無鈣、鎂磷酸鹽緩沖液PBS清洗2次后加入足量PBS水合3小時后按照5g/L的濃度配制成微載體母液，高溫蒸汽滅菌30分鐘后補加細胞培養用水到原濃度；

2)微載體的保存：高壓滅菌后的微載體分裝入潔凈的離心管中，于4℃保存；

3)細胞接種：在離心管中按照1*10⁵細胞/ml加入細胞以及適量細胞培養基，在另一個離心管中按照5mg/100ml加入全量微載體以20mlPBS清洗兩次后盡量吸棄PBS并加入細胞懸液充分混勻后，在CO₂培養箱中孵育30分鐘，期間每10分鐘顛倒混勻一次，最后將混合液按照培養瓶的體積加入細胞培養瓶中，放入CO₂培養箱中培養；

4)細胞培養、換液：將接種好的細胞在細胞培養箱中靜置培養，按照每天半換液、每3天全換液的方法持續培養，在進行全換液時將所有微載體以PBS清洗兩次后加入新鮮培養基；

5)細胞的傳代以及擴大培養：顯微鏡下觀察當微載體上細胞生長達到最大密度時，將所有微載體回收后，以PBS清洗2次后按照1/6擴大培養，補加5/6量的新鮮微載體和足量的細胞培養基；

6)Hyperflask大規模培養：將初步放大培養的細胞經PBS清洗兩次后，加入560ml完全培養基和以及按照5mg/100ml補加微載體后，充分混合，移入Hyperflask中繼續擴大培養；

7)細胞的回收、計數以及活率統計：待微載體上細胞生長達到最大量時，將全部的微載體回收以PBS清洗2次后再以PBS-EDTA清洗2次后加入胰酶-EDTA消化至細胞全部脫落，對回收的細胞進行細胞計數以及計算活率。

3.根據權利要求2所述的體外大量擴增細胞系以及間充質干細胞的方法，其特征在于，所述PBS-EDTA含有質量百分比0.2％EDTA；所述胰酶-EDTA為質量百分比0.5％胰酶+0.2％EDTA+99.3％PBS。