[發明專利]一種體外大量擴增細胞系以及間充質干細胞的方法

有效

• 申請號: 201110268612.5
• 申請日: 2011-09-13
• 公開（公告）號: CN102321566A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 黃家學;陳曉波;韓洪起;侯士芳;張宇光;韓俊領;陳勇
• 申請（專利權）人: 協和干細胞基因工程有限公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;C12N5/0775
• 代理公司: 天津才智專利商標代理有限公司 12108
• 代理人: 王曉紅

技術領域

本發明涉及一種擴增細胞系以及間充質干細胞的方法，尤其是一種應用微載體結合Hyperflask在體外大量擴增細胞系以及間充質干細胞的方法。

背景技術

近年來有關干細胞的研究日益深化，隨著相關知識的不斷積累干細胞成為人類對抗疾病的全新的武器。目前，關于干細胞多向分化能力的研究發現可以將來源于不同組織的干細胞應用于器官、組織疾病的治療，例如比較容易獲得的造血干細胞和間充質干細胞已經被廣泛的應用于不同組織的各種疾病的治療研究，并且在治療心血管疾病、神經損傷疾病以及代謝疾病方面取得了比較令人振奮的結果。

但是，在干細胞的臨床應用過程中如何獲得大量的細胞成為了關鍵問題，并且也成為了瓶頸問題，因為無論是造血干細胞或者臍帶間充質干細胞在細胞數量上都是有限的。關于如何在體外大量擴增干細胞的研究越來越受到研究人員的重視，雖然也取得了一定的進展但遠不能達到臨床應用的需求。

Hyperflask是康寧公司的一個新式細胞培養容器，其體積與T175細胞培養瓶相當，卻可以提供10倍T-175的培養面積，適合貼壁細胞的大規模培養擴增。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，提供一種充分利用hyperflask系統的優勢，應用微載體結合Hyperflask在體外大量擴增細胞系以及間充質干細胞的方法。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種體外大量擴增細胞系以及間充質干細胞的方法，應用微載體結合Hyperflask細胞培養容器在體外大量擴增細胞系以及間充質干細胞。

具體包括以下步驟：

1)微載體的預處理：適合于細胞表面貼壁生長的微載體以無鈣、鎂磷酸鹽緩沖液PBS清洗2次后加入足量PBS水合3小時后按照5g/L的濃度配制成微載體母液，高溫蒸汽滅菌30分鐘后補加細胞培養用水到原濃度；

2)微載體的保存：高壓滅菌后的微載體分裝入潔凈的離心管中，于4℃保存；

3)細胞接種：在離心管中按照1*10⁵細胞/ml加入細胞以及適量細胞培養基，在另一個離心管中按照5mg/100ml加入全量微載體以20mlPBS清洗兩次后盡量吸棄PBS并加入細胞懸液充分混勻后，在CO₂培養箱中孵育30分鐘，期間每10分鐘顛倒混勻一次，最后將混合液按照培養瓶的體積加入細胞培養瓶中，放入CO₂培養箱中培養；

4)細胞培養、換液：將接種好的細胞在細胞培養箱中靜置培養，按照每天半換液、每3天全換液的方法持續培養，在進行全換液時將所有微載體以PBS清洗兩次后加入新鮮培養基；

5)細胞的傳代以及擴大培養：顯微鏡下觀察當微載體上細胞生長達到最大密度時，將所有微載體回收后，以PBS清洗2次后按照1/6擴大培養，補加5/6量的新鮮微載體和足量的細胞培養基；

6)Hyperflask大規模培養：將初步放大培養的細胞經PBS清洗兩次后，加入560ml完全培養基和以及按照5mg/100ml補加微載體后，充分混合，移入Hyperflask中繼續擴大培養；

7)細胞的回收、計數以及活率統計：待微載體上細胞生長達到最大量時，將全部的微載體回收以PBS清洗2次后再以PBS-EDTA清洗2次后加入胰酶-EDTA消化至細胞全部脫落，對回收的細胞進行細胞計數以及計算活率。

所述PBS-EDTA含有質量百分比0.2％EDTA；所述胰酶-EDTA為質量百分比0.5％胰酶+0.2％EDTA+99.3％PBS。

本發明的有益效果是：應用商品化微載體結合Hyperflask在體外能夠在較小的培養空間中大量的擴增細胞，從而在節約成本的前提下大量的獲得目的細胞。微載體培養結合Hyperflask培養技術一定程度上克服了最初的轉瓶培養的不足，具有很多優點：

1)不需要額外的細胞培養設備-轉瓶培養箱。

2)操作簡單，應用常規的細胞培養設備可以完成。

3)相同的培養體積下可以獲得更多的細胞。

4)節省培養基、血清、胰酶用量。

5)細胞傳代簡便。

6)兼具單層培養和懸浮培養的優勢，且是均相培養。

7)細胞所處環境均一。

8)環境條件(溫度、pH和CO₂等)容易測量與監控。

9)具有較高的比表面積。

附圖說明

圖1微載體培養COS1細胞

圖2微載體培養rADSC細胞