[發明專利]一種細胞色素C的純化工藝

無效

• 申請號: 201110268301.9
• 申請日: 2011-09-13
• 公開（公告）號: CN102295699A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發明（設計）人: 王超展;樊花;陳湘琴
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: C07K14/80
• 分類號: C07K14/80;C07K1/20
• 代理公司: 西安西達專利代理有限責任公司 61202
• 代理人: 謝鋼

技術領域

本發明涉及一種細胞色素C的純化工藝，具體涉及采用前沿疏水色譜法純化細胞色素C的工藝，屬于生化分離技術領域。

背景技術

細胞色素（cytochrome）是各種生物體中都很常見的蛋白質，它是一類含有鐵卟啉基團的電子傳遞蛋白，只存在于需氧細胞中，廣泛存在于真核生物的線粒體內膜和內質網中，植物的葉綠體中，以及光合成微生物和細菌中。細胞色素在線粒體內膜上起傳遞電子的作用。細胞色C?(cytochrome?c)?是細胞色素的一種，它在線粒體呼吸鏈上位于細胞色素B?和細胞色素氧化酶之間，是呼吸鏈的一個重要組成部分。每分子細胞色素C含有一個血紅素和一條多肽鏈。細胞色素C是一種穩定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸性緩沖液提取。它對熱比較穩定，不易變性，對酸堿也較穩定，可抵抗0.3?mol/L氫氧化鉀溶液的長時間處理。

在酶存在的情況下，細胞色素C對組織的氧化、還原有迅速的酶促作用。通常外源性細胞色素C不能進入健康細胞，但在缺氧時，細胞膜的通透性增加，細胞色素C便有可能進入細胞及線粒體內，增強細胞氧化，提高氧的利用。細胞色素C可用于組織缺氧的急救和輔助用藥，如一氧化碳中毒、催眠藥中毒、新生兒窒息、嚴重休克缺氧、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困難、高山缺氧、腦缺氧、心臟疾病引起的缺氧等。

目前臨床上應用的細胞色素C主要是從豬心中分離純化的制品。其技術路線為：將新鮮豬心攪碎后得心肌碎肉，用稀硫酸溶液提取，用稀氨水中和，將所得提取液吸附于人造沸石，用低濃度的硫酸銨溶液進行洗脫，再依次用硫酸銨沉淀法和三氯乙酸沉淀法對洗脫液進一步純化，將所得沉淀溶解后對蒸餾水進行透析，然后再用弱陽離子交換樹脂對其進行精純化。目前工業上主要采用這一工藝路線制備細胞色素C。這種工藝路線繁瑣、步驟多、耗時長，每公斤豬心僅可得約200?mg細胞色素C。

近年來，一些研究人員對此路線進行了一些改進。其中結果較好的是李寶珠等（李寶珠,?趙麗哲,?寧曉玲，中國生化藥物雜志，1995,?16,?221-223）用凝膠過濾色譜法，以葡聚糖凝膠Sephadex?G-200為分離介質，代替了上述傳統技術路線中的弱陽離子交換色譜，使得細胞色素C的產率提高到340?mg/kg豬心；然而，凝膠過濾色譜法的樣品負載量低，不利于大規模成產，而且凝膠過濾法分離速度很低，導致該方法比廣泛采用的傳統方法更加耗時。美國Amberlite?IRC-50陽離子交換樹脂是目前細胞色素C純化中應用最為廣泛的樹脂，價格很高，雖然有人嘗試用國產的樹脂代替它，但效果均不理想（何獻君,?陳紅,?陳雅惠,?等,?中國生化藥物雜志,?2008,?29(5):?324-326）。上述方法不但繁瑣耗時，而且無一例外都采用了三氯乙酸沉淀對細胞色素C進行純化，三氯乙酸極易引起細胞色素C的變性聚合和脫酰胺（李寶珠,?趙麗哲,?寧曉玲，中國生化藥物雜志，1995,?16,?221-223）。

姚從等（姚從,?柯從玉,?白泉,?等，色譜，2004,?22:?399-402）采用疏水色譜法一步從豬心提取液中獲得了高純度的細胞色素C，這種方法雖然簡單方便，但由于未經過硫酸銨或三氯乙酸沉淀等前處理，雜蛋白含量太多，使得色譜柱上絕大部分吸附位點被雜蛋白所占據，蛋白純化效率低，只適合實驗室規模的分離純化，不適用于大規模的生產。為了提高色譜柱的利用效率，將豬心細胞色素C的粗提液首先用硫酸銨沉淀，然后將細胞色素C和剩余雜蛋白同時吸附在疏水色譜柱上，然后再用疏水色譜法在洗脫模式下對其進行分離（姚從，西北大學碩士學位論文，西安，2004），使得細胞色素C的上樣量和色譜柱的利用效率得到了較大程度的提高。然而，柱填料利用率和生產效率仍然比較低。

發明內容

本發明的目的是提供一種細胞色素C的純化工藝，以克服現有技術純化步驟多、色譜填料利用率低、生產效率低等不足。

一種細胞色素C的純化工藝，包括以下步驟：

（1）從動物臟器或者酵母中提取得到細胞色素C的粗提液；

（2）向粗提液中加入無機鹽進行鹽析，靜置離心棄去沉淀的雜蛋白，收集上清液；

（3）加緩沖液調節上清液中無機鹽濃度至20%?~?35%，再用前沿疏水色譜法對其進行純化，即將所得溶液連續上樣于預先用20%?~?35%的無機鹽溶液平衡過的疏水色譜柱中，收集穿透液；

（4）用20%?~?35%無機鹽溶液沖洗色譜柱至吸光度達到穩定，收集色譜流出液，與穿透液合并，即為純化后的細胞色素C。

所述動物臟器是豬、牛、羊、馬或狗的心臟、肝臟、腎臟。