[發明專利]一體化緩沖液及使用該一體化緩沖液分離核酸的方法

無效

• 申請號: 201110267880.5
• 申請日: 2011-09-09
• 公開（公告）號: CN102533725A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 周永剛;譚文斌
• 申請（專利權）人: 上海佑科生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C07H21/00;C07H1/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物學應用領域的一種用一個從各式各樣的樣本來源中分離和純化核酸的一體化緩沖液，以及與使用固相硅膠基質分離核酸的方法。

背景技術

目前，核酸通常要求無雜質，雜質會干擾下游的處理或分析過程，例如逆轉錄，克隆，限制酶分析，測序，轉染，連接，體內注射，聚合酶鏈反應，等等。雜質物常為(1)大分子例如蛋白，多糖，多核苷酸；(2)鹽，化學藥品，有機溶劑，微量金屬，染料；(3)從生物的樣本而來的成分例如內毒素，脂類，低分子量酶抑制劑，核苷酸。這些雜質常常阻礙或抑制在許多分子生物學技術中廣泛應用的化學反應，或降解，分離或聚合核酸同其他成分。從復雜的系統中提取得到無雜質的核酸的過程是繁復的。這些復雜的系統，例如細胞，組織，血液，瓊脂糖，聚丙烯酰胺凝膠，溶液，都包含大量雜質。所以對于多數分子生物學應用而言，使用簡單而有效的方法從復雜的系統中提取高純度核酸是必須的。

在過去二十多年中已發展了許多關于從不同樣本來源分離核酸的方法。常規分離核酸的方法是借用有機溶劑，例如苯酚和氯仿，來裂解生物樣本和從而提取核酸，在鹽的存在下由乙醇或異丙醇將核酸沉淀出來。這些方法有重大的缺點：第一它用有機物質、化學物來提取核酸。對許多酶而言，這些物質通常是強烈的抑制劑。第二，它需要用有機溶劑多次提取使核酸從其他生物成分例如蛋白，油脂，細胞的細胞器等等中分離。第三，這些使用的有機溶劑是有毒的，例如苯酚，氯仿。處理這些溶劑要特別的慎重和保護。最后，苯酚是一個強烈氧化劑——能氧化核酸從而導致毀損核酸。

硅膠基質技術是之后開發出來分離核酸的一種方法。與以上描述的傳統方法比較，硅膠基質技術優勢在于簡單，高效，無需有機溶劑，提取的核酸高純度。硅膠基質分離核酸基本原理主要包括：

(1)在高的鹽濃度下，鈉離子打破水和二氧化硅中帶負電荷的氧離子間的氫鍵。鈉作為一個陽離子橋，吸引核酸分子中磷酸鹽帶負電荷的氧離子。

(2)通過幾次洗滌脫氧核糖核酸-硅膠基質后，鹽被消除，基因能被三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶劑或水從硅膠基質上洗脫分離。

當然，硅膠基質包括很多二氧化硅材料例如玻璃顆粒，玻璃粉，二氧化硅顆粒，玻璃超細纖維，硅膠膜等等。二氧化硅顆粒和硅酸顆粒存在的問題是很大程度上取決于如何被包裝，并且很難被復制。硅膠膜技術能提供一個一致且均一的二氧化硅表面從而使結果可重復，過程更簡單。

核酸分子結合到硅膠表面依賴于某些鹽的存在，在并需要一定的pH條件。一般來說，離液試劑和某些非離液鹽強度和pH值條件是核酸與硅膠結合所必需的。許多離液試劑如胍鹽酸鹽，異硫氰酸胍，碘化鈉，鈉高氯酸鹽和三氯乙酸鈉已在這個方面使用。然而，不同研究者發現這些離液試劑的最佳濃度并不同，從0.5M至7M，和pH值范圍從3.6至6.8。沒有一個溶液優化的濃度和組分被明確定義。此外，不同離液試劑用于不同目的的分離程序。例如，鹽酸胍，主要是用于在質粒脫氧核糖核酸的提取和脫氧核糖核酸的純化，硫氰酸胍被廣泛應用于核糖核酸的提取，碘化鈉被用于從瓊脂糖凝膠回收脫氧核糖核酸片段。研究人員不得不購買不同的溶液以用于不同目的核酸分離，紛繁復雜。

綜上所述，為了避免上述情形，一種新的，從復雜的系統中提取高純度核酸的方法的發明是勢在必行的。

發明內容

本發明的目的是解決如下技術問題：常規借用有機溶劑分離核酸的方法，有機溶劑或者是強烈的抑制劑，或者是有毒的、或者是能氧化核酸從而導致毀損核酸；而之后開發出來分離核酸的硅膠基質技術由于沒有一個溶液優化的濃度和組分被明確定義，而且，不同分離液試劑用于不同目的的分離程序，造成研究人員不得不購買不同的溶液以用于不同目的核酸分離，紛繁復雜；都不能簡單，高效的從復雜的系統中提取高純度核酸。

本發明提供了一種從復雜的系統中提取高純度核酸的方法，該方法中提供了一種一體化緩沖液，其包括優化的離液試劑，非離液鹽強度，pH值，以實現最大的硅膠膜與核酸結合。這溶液可用于所有目的的核酸分離，包括質粒脫氧核糖核酸的提取，脫氧核糖核酸凝膠回收和溶液中脫氧核糖核酸純化等；不再需要研究人員購買不同的溶液以用于不同目的核酸分離，簡單便捷。

本發明提供一種本發明的目的通過以下技術方案來實現：

一種一體化緩沖液，可用于不同目的的核酸分離，其特征在于，其包括：離液試劑、非離液試劑以及硅膠膜柱。

所述離液試劑包括異硫氰酸胍，所述硫氰酸胍的終濃度為2.0M至2.5M。

所述非離液試劑包括氯化鈉和/或鉀醋酸，所述氯化鈉濃度為130mM至140mM；醋酸鉀濃度為0.3M。