[發明專利]β-葡聚糖內切酶PEGase-2基因及其表達產物和應用

無效

• 申請號: 201110266089.2
• 申請日: 2011-09-08
• 公開（公告）號: CN102321646A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 邢苗;劉士德;張建華;李小青;田生禮;歐陽秋玲
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N9/42;C12P19/14
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 何平

【技術領域】

本發明涉及分子生物學，尤其涉及一種β-葡聚糖內切酶PEGase-2基因及其表達產物和應用。

【背景技術】

β-1，3(4)-葡聚糖內切酶(Endo-β-1，3(4)-glucanase，EGase，以下簡稱“β-葡聚糖內切酶”，酶學分類號為EC3.2.1.73)是一類能偶特異性的水解β-1，3(4)-葡聚糖中與β-1，3糖苷鍵毗鄰的β-1，4糖苷鍵的糖苷水解酶(glycosylhydrolases，GH)，水解產物通常為3～5個寡糖^[1]。

大麥芽是啤酒生產的主要原料，大麥胚乳細胞壁約70％的組分為β-1，3(4)-葡聚糖^[2]。在啤酒釀造過程中，糖化過程變性的蛋白質會與過量的β-1，3(4)-葡聚糖結合會造成酵母早期沉積，從而影響發酵，并導致啤酒釀造過程中的雙乙酰還原期延長；過量的β-1，3(4)-葡聚糖還會引起啤酒渾濁和沉淀，影響啤酒的品質。因此，啤酒在原料糖化后，要添加適量的β-葡聚糖內切酶以水解原料中的β-1，3(4)-葡聚糖。麥片因纖維含量高、營養價值高成為老年人喜愛的食品，但食用過量的麥片容易引起老年人消化不良，因此，在麥片中添加適量的β-葡聚糖內切酶或食用麥片后再食用幾片含β-葡聚糖內切酶的多酶片可以有助于消化。玉米胚乳細胞壁中也含大量β-1，3(4)-葡聚糖，崽豬食用以玉米為主要原料的飼料時容易引起消化不良。因此，在飼料中添加適量的β-葡聚糖內切酶，讓崽豬及早食用可消化的飼料，可以讓崽豬及早斷奶，從而提高生豬的生產效率。

植物、真菌和細菌都含有β-葡聚糖內切酶，植物β-葡聚糖內切酶屬于糖苷水解酶的GH17家族，而微生物β-葡聚糖內切酶則屬于糖苷水解酶的GH16家族。盡管GH16和GH17家族的β-葡聚糖內切酶有相似的功能，但他們在結構上卻沒有相似性，GH17家族成員的三級結構呈(β/α)₈桶狀^[3]，而GH16家族成員的三級結構則呈β-三明治折疊卷狀^[4]。大麥β-葡聚糖內切酶在種子萌芽早期表達量最高，其最適pH值(pH_opt)為4.6、最適溫度(T_opt)為45℃^[5，6]。芽孢桿菌β-葡聚糖內切酶也能特異水解大麥β-1，3(4)-葡聚糖，其pH_opt介于6.0～7.5、T_opt介于58℃～60℃^[7-13]，但該類β-葡聚糖內切酶大多對酸環境敏感^[1]。浸麻芽孢桿菌β-葡聚糖內切酶是最耐熱的β-葡聚糖內切酶之一，T_opt為65℃，在75℃時還有80％的活性，pH_opt為中性。淀粉液化芽孢桿菌的β-葡聚糖內切酶的pH_opt為6.0，受酸性環境影響最小^[14]。用淀粉液化芽孢桿菌β-葡聚糖內切酶N端的16個氨基酸替換浸麻芽孢桿菌β-葡聚糖內切酶N端的16個氨基酸組合成的雜合酶H(A16-M)在80℃時還有80％的活性，對酸性環境耐受能力有所提高，對大麥β-1，3(4)-葡聚糖的特異性還比野生型浸麻芽孢桿菌β-葡聚糖內切酶還高40％^[15]，但國內沒有該類酶的知識產權，啤酒行業使用的β-葡聚糖內切酶目前主要依賴進口。真菌β-葡聚糖內切酶水解的底物比大麥和芽孢桿菌β-葡聚糖內切酶廣泛，不僅能水解大麥β-1，3(4)-葡聚糖，還能水解羧甲基纖維素和昆布多糖^[16-19]。盡管國內在芽孢桿菌β-葡聚糖內切酶和真菌β-葡聚糖內切酶上也有一定的研究^{[11-13，19，20]}，但能替代進口產品的β-葡聚糖內切酶還沒有出現。

【發明內容】

基于此，有必要提供一種能夠表達具有β-葡聚糖內切酶活性的蛋白的β-葡聚糖內切酶PEGase-2基因，并提供其表達產物及應用。

一種β-葡聚糖內切酶PEGase-2基因，包括如下序列：

(a)、編碼由SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補鏈；

(b)、和編碼由SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列組成的多肽的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互補鏈；

(c)、編碼多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互補鏈，所述多肽由SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列組成，其中一個或多個氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有β-葡聚糖內切酶活性；或