[發明專利]一種利用激流式生物反應器懸浮培養動物細胞的工藝過程及控制方法

有效

• 申請號: 201110265840.7
• 申請日: 2011-09-08
• 公開（公告）號: CN102994442A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 張秀芹;劉鐵成;張雪亭;王延濤;楊威;李會成
• 申請（專利權）人: 哈藥集團技術中心
• 主分類號: C12N5/02
• 分類號: C12N5/02;C12N5/07;C12P21/00;C12P21/08;C12M3/02;C12M1/38;C12M1/36
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技術領域

本發明屬于細胞工程技術，涉及動物細胞大規模培養及生產重組蛋白藥物的工藝，具體涉及動物細胞無血清高密度，高表達懸浮培養工藝過程控制方法。

背景技術

動物細胞大規模培養已成為生物制藥領域最重要的關鍵技術之一，并隨著重組治療性蛋白類藥物的廣泛應用而迅速發展。目前工業化生產動物細胞表達重組蛋白治療藥物的主要方法是通過生物反應器，在體外大規模高密度培養雜交瘤細胞、工程細胞、昆蟲細胞和微生物等，再通過相關的純化手段制備重組蛋白產品。

用于細胞大規模培養的生物反應器有攪拌式生物反應器，氣升式生物反應器，中空纖維生物反應器，固定床式生物反應器，旋轉式生物反應器，一次性生物反應器。[SINGH?Vijay.Disposable?bioreactor?for?cell?cumture?using?wave-induced?agitation[J].Cytotechnology，1999，30：149-158.][2]SlivacI，V?G，K，I?and?Kniewald?Z?2006Aujeszky’sdisease?virus?production?in?disposable?bioreactor[J].Biosci.31：363-368.]攪拌式生物反應器的最大優點是能培養各種類型的動物細胞，培養工藝容易放大，產品質量穩定，適合于工業化生產，在生物制品開發中潛力很大。但這種生物反應器也有不足之處，即機械攪拌會產生高剪切力，對細胞造成某種程度上的損傷。氣升式生物反應器能在通氣的同時，利用其獨特的回路循環裝置使液相達到循環。最常見的為管道或板柱內循環氣升式生物反應器。外循環氣升式反應器，將下降管置于反應器外部，可用于高細胞濃度灌注培養。缺點相對來說較少，主要是高密度培養時混合不夠均勻。中空纖維生物反應器的主要組成部分是一充滿培養液的閉合管道，管道中插入半通透性的中空纖維。中空纖維為培養細胞提供營養物質并運走代謝廢物。但是細胞密度過高會妨礙氧的擴散，使細胞的得氧量不同。同時，此反應器中還存在著營養物質和代謝產物的濃度差，這就導致了細胞生長的不均一性。[李寶香，郭德倫，張瑩三維細胞培養技術及相關儀器的進展和應用]填充床生物反應器中填充了某種材料，作為固定細胞的載體，填料顆粒堆疊成床。培養液可以在床層中流動。它沒有機械攪拌和氣泡，所以剪切力小，適合細胞培養。但該反應器的最大缺點是混合效果差，傳質、傳氧效率低。[動植物細胞培養生物反應器的研究進展王志江，鄭裕國旋轉式生物反應器(RCCS)主要由控制裝置和培養容器兩部分組成。培養容器主要由內外兩個圓筒組成，內、外筒可相對獨立地旋轉。整個容器由電機驅動沿水平軸旋轉，細胞顆粒在水平軸內建立均質的液體懸浮軌道。由于該系統無推進器、空氣升液器、氣泡或攪拌器，細胞顆粒不與容器壁或任何其它易致傷的物體相碰，故幾乎沒有破壞性的剪切力。普通生物反應器由于通過攪拌保持細胞的懸浮而產生的剪切力破壞了細胞間和細胞與基質問的穩定，使組織和細胞集中于自身的修復，而大大影響其生長和其它的正常生理功能。由于有很好的物質交換功能，細胞在RCCS中能以很高的密度生長，其細胞的培養密度可達到10⁸，故可快速大規模地培養細胞。此外，這種培養能提供本能的分化、高細胞增殖、低的細胞死亡率和增加細胞產物的分泌。[Fang?A，Pierson?D?L.Mishra?SK.etal.Growth?of?Streptomyces?hygroscopicusinrotating?wall?bioreactor?under?simulated?microgravity?inhibits?rapamycin?production[J].Appl?Microbiol?Biotecknol.2000，54：33.]一次性生物反應器是最近發展起來的新式反應器，由預先消毒的、可被FDA認可的、對生物無害的聚乙烯塑料箱組成，箱中部分填充培養液并接種細胞，箱中其余部分是空氣。使用前箱體用r射線消毒，用后丟棄。特殊的開孔可進行無菌加樣、取樣，而不必把生物反應器置于層流罩中，裝置簡單，易于操作，成本低，低剪切力，無空氣鼓泡減低了氣泡對細胞的損害，可用于培養動物細胞和植物細胞并十分適合生產病毒。此反應器已經成功懸浮培養重組NSO細胞生產單克隆抗體；懸浮培養人293細胞生產腺病毒；用昆蟲sf?9細胞生產棒狀病毒；用微載體Cytodex?3培養人293細胞。[林福玉，陳昭烈等.大規模動物細胞培養的問題及對策.生物技術通報.1999，1：32-35.]