[發明專利]單核細胞增生性李斯特菌IC-PCR檢測試劑盒和制備方法

無效

• 申請號: 201110265732.X
• 申請日: 2011-09-08
• 公開（公告）號: CN102286630A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 劉雅莉;劉箐
• 申請（專利權）人: 劉箐;劉雅莉
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張真

技術領域

本發明涉及一種針對四大食源性致病菌之一的單核細胞增生性李斯特菌(Listeria?monocytogenes,LM)分子水平的免疫捕捉PCR(Immuno-capture?PCR,IC-PCR)檢測試劑盒，可以用于食品中單核細胞增生性李斯特菌的常規檢測。

背景技術

近年來，食源性疾病屢屢發生，食品安全問題已經成為全球關注的公共衛生問題，而食源性致病菌正是食品安全問題的嚴重隱患。單核細胞增生性李斯特菌(Listeria?monocytogenes,LM)是常見的食源性致病菌，廣泛存在于自然界，可感染多種肉制品、奶制品、水產品以及植物性產品；它是李斯特菌屬中致病力最強的細菌，可導致嚴重的人畜共患病，如腦膜炎、敗血癥及流產等，孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷病人是易感人群，病死率高達30-70%。有研究表明，人類李斯特菌感染約99％屬食源性，而Prazak等的研究表明，LM在食品特別是即食性食品中的污染率達3％。由于LM引起的感染病死率高、危害大，已成為全球性疾病，引起了國際上的高度重視，目前WHO將其列為20世紀90年代四大食源性致病菌之一，并在2000年建立了全球監測網，在世界范圍內開展與單核細胞增生性李斯特菌相關的監測。我國也在2000年建立了全國食品污染物監測網和食源性疾病監測網，單核細胞增生性李斯特菌是其中重要監測菌之一，因此在食品上市和消費前開展李斯特菌的相關檢測非常必要，但是在實際樣品（如牛奶、肉制品等）中LM數量很少，這給檢測帶來了很大困難。

目前，我國對LM的檢測主要采用傳統的分離培養檢測及鑒定、ELISA和PCR技術。國標法GB4789.30-2008《食品衛生微生物學檢驗：單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》需要增菌和分離培養，一般需3-14天，耗時長、工作量大，不適應目前對病原檢測靈敏、快速、特異的要求，但其在爆發流行病的檢測和傳染源的追蹤方面是其他方法不可替代的；在實際樣品(如牛奶、肉制品等)中單增李斯特菌數量很少，這給檢測帶來了很大的難度。ELISA方法操作簡便，可在同一時間內檢測大量樣品，但由于菌體及鞭毛抗原交叉反應的存在，難以進行李斯特菌種間的特異性鑒別，且檢測靈敏度較低；目前，我國出入境檢驗檢疫行業標準SN/T1869-2007《食品中多種致病菌快速檢測方法：PCR法》采用Direct-PCR檢測LM。Direct-PCR技術相對傳統方法和ELISA檢測靈敏度高，但同時也存在一定的局限性，需要對樣品進行前處理即提取DNA，首先樣品前處理的好壞很大程度上影響PCR檢測的結果；而且在DNA抽提過程中無疑損失了大量病原菌，因而不可避免的降低了PCR的檢測靈敏度。其次，某些食品中本身就含有對PCR有干擾或抑制的成分（本實驗對生豬肉的PCR檢測中就遇到此類問題），因而檢測前病原菌的純化和富集尤為重要。最常用的富集方法就是生物學培養，采用該方法增菌雖然可以大大提高檢出率，提升檢測靈敏度，但是其增加了檢測時間，難滿足快速檢測的要求。

發明內容

本發明的目的是避免現有的食源性致病菌檢測技術的不足提供一種單核細胞增生性李斯特菌的IC-PCR檢測試劑盒。建立一種新的微量病原檢測技術。IC-PCR試劑盒結合了DAS-ELISA捕捉抗原與PCR高效擴增的優點，一方面除去了對PCR擴增有抑制的物質，另一方面可以抑制雜菌，使目標菌達到一定的純度和濃度，從而提高了檢測靈敏度，使捕捉效率達到96%以上，避免了假陽性的出現，同時省去了核酸提取過程，縮短了檢測周期，特別適合食品中微量致病菌的檢測。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：一種單核細胞增生性李斯特菌的IC-PCR檢測試劑盒，其主要特點是包括有：單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體包被的PCR管，含Mg²⁺的10×PCR?Buffer管，2.5mM?dNTP?管，5U?TaqDNA聚合酶管，10?pmol/μL引物5’-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3’和5’-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3’各1管，滅菌ddH₂O?管，陽性對照1管，陰性對照管，PBST洗滌緩沖液管。

一種單核細胞增生性李斯特菌的IC-PCR檢測試劑盒的使用方法，其主要特點是步驟為：

(1)病原菌的純化和富集：在包被好單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體的PCR管中依次加入待檢樣品，陽性對照熱滅活的單核細胞增生性李斯特菌，陰性對照無菌PBS，37℃孵育4小時；之后用PBST洗滌緩沖液洗滌PCR管3次，每次1min，棄去洗滌液；