[發明專利]單核細胞增生性李斯特菌IC-PCR檢測試劑盒和制備方法

無效

• 申請號: 201110265732.X
• 申請日: 2011-09-08
• 公開（公告）號: CN102286630A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 劉雅莉;劉箐
• 申請（專利權）人: 劉箐;劉雅莉
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張真

1.一種單核細胞增生性李斯特菌的IC-PCR檢測試劑盒，其特征是包括有：單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體包被的PCR管，含Mg²⁺的10×PCR?Buffer管，2.5mM?dNTP?管，5U?TaqDNA聚合酶1管，10?pmol/μL引物5’-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3’和5’-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3’各1管，滅菌ddH₂O?1管，陽性對照管，陰性對照管，PBST洗滌緩沖液管。

2.一種單核細胞增生性李斯特菌的IC-PCR檢測試劑盒的使用方法，其特征是步驟為：

(1)病原菌的純化和富集：在包被好單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體的PCR管中依次加入待檢樣品，陽性對照熱滅活的單核細胞增生性李斯特菌，陰性對照無菌PBS，37℃孵育4小時；之后用PBST洗滌緩沖液洗滌PCR管3次，每次1min，棄去洗滌液；

(2)PCR擴增：在上述PCR管中加入含Mg²⁺的PCR?10×PCR?Buffer?5μL，2.5mM?dNTP?2μL，Taq?DNA?Polymerase?2.5?U，引物5’-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3’和5’-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3’各0.6pmol/μL，用ddH₂O補足50μL；進行PCR擴增，擴增條件為95℃預變性20?min，95℃30s，55℃45s，62℃30s,進行35個循環，72℃延伸5min，4℃保存；

(3)結果分析：取10μL擴增產物于1.5%瓊脂糖電泳檢測目標條帶并成像分析，若陽性對照和檢測樣品在234bp處可見特異性目標條帶，陰性對照沒有特異性目標條帶，則判定檢測樣品為陽性。

3.一種單核細胞增生性李斯特菌的IC-PCR檢測試劑盒特異性PCR包被管的制備方法，其特征是步驟為：

(1)用包被緩沖液將單核細胞增生性李斯特菌單克隆抗體稀釋至5.0μg/mL，稀釋好的抗體按照每管50μL加入PCR管4℃包被抗體過夜；

(2)PBST洗滌PCR管3次，每次1min；甩干PCR管中的水分，-20℃保存；

(3)包被緩沖液配方：無水碳酸鈉1.59g/L、碳酸氫鈉2.93g/L、疊氮化鈉0.2g/L，調pH至9.6；PBST洗滌緩沖液配方：氯化鈉8g/L、無水磷酸氫二鈉1.15g/L、無水磷酸二氫鉀0.2g/L、氯化鉀0.2g/L、吐溫20?0.5ml/L，調pH至7.4。

4.一種單核細胞增生性李斯特菌的IC-PCR檢測試劑盒食品中致病菌的檢測方法，其特征是步驟為：

(1)稱取25g食品與250ml無菌磷酸鹽緩沖液混合，并以此混合液作為稀釋液梯度稀釋李斯特菌純菌液；

(2)將制備好的梯度模擬菌液加入包被抗體的PCR管中孵育并進行IC-PCR擴增;

(3)磷酸鹽緩沖液配方：加入磷酸二氫鉀34g/500mL，調pH至7.2。