[發明專利]克隆載體

有效

• 申請號: 201110264537.5
• 申請日: 2011-09-01
• 公開（公告）號: CN102382851A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 棚瀨智雄
• 申請（專利權）人: 寶生物工程株式會社
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N15/64
• 代理公司: 北京天昊聯合知識產權代理有限公司 11112
• 代理人: 丁業平;張天舒

技術領域

本發明涉及適于PCR產物克隆的載體、使用該載體的克隆方法、該載體的制造方法以及含有該載體的試劑盒。

背景技術

迄今為止，作為目的基因的分離方法已知有利用PCR的方法。在該方法中，首先通過PCR擴增含目的基因的DNA或其片段，將得到的PCR產物組裝到克隆用質粒載體中，進一步使用該質粒載體使宿主轉化從而形成轉化體的單菌落。接下來，由所形成的單菌落精制質粒，對插入到質粒中的DNA片段進行確認。通過這樣做，可得到插入有目的基因或其片段的質粒。

在PCR法所用的酶中，已知代表性的Taq?DNA聚合酶中存在這樣的副反應活性：在復制后的DNA產物的3′末端以非模板依賴性的方式添加1個脫氧腺苷(dA)殘基。因此，使用存在這樣副反應活性的DNA聚合酶擴增的雙鏈DNA片段的大部分具有添加了1個脫氧腺苷殘基的3′端突出結構。

已開發了利用Taq?DNA聚合酶并利用開環載體(T載體)的TA克隆法，其中所述開環載體在兩個3′末端具有突出的1個脫氧胸腺嘧啶核苷(dT)殘基(非專利文獻1)。通過采用TA克隆法，可在不進行PCR產物的限制性酶處理和末端平滑化處理的情況下得到插入有PCR產物的重組質粒。

然而，傳統的TA克隆法存在缺點。在TA克隆中，在含有插入有PCR片段的質粒的轉化體鑒別中，通常利用β-半乳糖苷酶基因的α-互補性，即，所謂的藍白篩選。然而，有時存在以下情況：在相對于衍生自β-半乳糖苷酶的α肽基因的堿基序列通過讀碼框插入PCR片段時，引起作為融合蛋白的α肽的表達。在這種情況下，導致呈現弱藍色的假陰性菌落的生成。

另外，在通常的TA克隆法中，不能控制插入到載體中的目的基因的方向性。為了消除該缺點制作了改良型T-載體。例如，在專利文獻1中披露了將生成第一限制性酶切位點的引物對與T-載體相組合的方法，其中這樣設計所述T-載體：僅在使用所述引物對沿逆向插入PCR擴增產物時出現第二限制性酶切位點。在該方法中，使用切斷第二限制性酶切位點的限制性酶僅切斷沿逆向插入的質粒，由此可以僅得到這樣的轉化體：其保持有沿期望方向插入有DNA片段的質粒。然而在該方法中，連接反應之后需要進一步進行限制性酶處理，操作變煩雜。

最近，有人報道了這樣的方法：為了控制在TA克隆法中生成假陰性菌落，利用致死基因作為選擇標記(非專利文獻2)。然而，在該方法中，不能控制插入到載體中的目的基因的方向性。

由以上可知，目前尚不存在這樣的克隆載體，其簡便地控制PCR擴增產物這樣的DNA片段的插入方向，同時可容易地選擇僅插入有目的DNA片段的克隆。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：國際公開第2005/021747號小冊子

非專利文獻

非專利文獻1：BioTechniques，1995年，第19卷，第1期，第34-35頁

非專利文獻2：Molecular?Biology?Reports，2009年，第36卷，第7期，第1793-1798頁

發明內容

發明要解決的課題

本發明的目的是提供克服了上述缺點的TA克隆用載體、使用該載體的克隆方法、該載體的制造方法以及含有該載體的試劑盒。

解決課題的手段

本發明人發現，借助于這樣的載體可解決上述課題從而本發明完成，該載體在末端配置了核酸序列缺失的活性喪失耐藥性基因，其中所述核酸序列對在耐藥性基因產物的耐藥性發揮中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸進行編碼。

即，本發明涉及：

[1]一種載體，其為由直鏈狀雙鏈DNA形成的克隆用載體，所述直鏈狀雙鏈DNA在兩個3′末端具有突出的1個脫氧胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷殘基，該載體的特征在于，其保持有對耐藥性基因產物的部分序列進行編碼的核酸，所述核酸為缺失了這樣的核酸序列的活性喪失耐藥性基因，該核酸序列對在所述耐藥性基因產物的耐藥性發揮中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸進行編碼，此外，所述核酸配置在所述雙鏈DNA中任一者的末端，使得在將其中末端部分含有所述活性喪失耐藥性基因中所缺失的核酸序列的插入DNA片段連接到載體時，構成了對沒有缺失的耐藥性基因產物進行編碼的核酸。