[發明專利]克隆載體

有效

• 申請號: 201110264537.5
• 申請日: 2011-09-01
• 公開（公告）號: CN102382851A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 棚瀨智雄
• 申請（專利權）人: 寶生物工程株式會社
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N15/64
• 代理公司: 北京天昊聯合知識產權代理有限公司 11112
• 代理人: 丁業平;張天舒

1.一種載體，其為由直鏈狀雙鏈DNA形成的克隆用載體，所述直鏈狀雙鏈DNA在兩個3′末端具有突出的1個脫氧胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷殘基，該載體的特征在于，其保持有對耐藥性基因產物的部分序列進行編碼的核酸，所述核酸為缺失了這樣的核酸序列的活性喪失耐藥性基因，該核酸序列對在所述耐藥性基因產物的耐藥性發揮中不可缺少的C末端部分的氨基酸或N末端部分的氨基酸進行編碼，此外，所述核酸配置在所述雙鏈DNA中任一者的末端，使得在將其中末端部分含有所述活性喪失耐藥性基因中所缺失的核酸序列的插入DNA片段連接到載體時，構成了對沒有缺失的耐藥性基因產物進行編碼的核酸。

2.權利要求1所述的載體，其中，所述活性喪失耐藥性基因為缺失了這樣的核酸序列的活性喪失耐藥性基因，該核酸序列對耐藥性基因產物的C末端部分的氨基酸進行編碼。

3.權利要求2所述的載體，其中，所述活性喪失耐藥性基因由對缺失了C末端氨基酸的β-內酰胺酶的氨基酸序列進行編碼的核酸序列形成。

4.權利要求3所述的載體，其中，所述活性喪失耐藥性基因由對序列表的序列號17中記載的氨基酸序列進行編碼的核酸序列形成。

5.權利要求1所述的載體，還包括第2耐藥性基因，所述第2耐藥性基因示出與前述耐藥性基因不同的對藥劑的耐藥性。

6.權利要求1所述的載體，其由由序列表的序列號5中記載的核酸序列形成的DNA以及由序列表的序列號18中記載的核酸序列形成的DNA形成。

7.一種克隆DNA的方法，包括以下步驟(a)～(d)：

(a)以DNA為模板，使用第一引物、與第一引物相對的第二引物、以及DNA聚合酶進行PCR的步驟；

(b)將通過步驟(a)得到的PCR產物與權利要求1～6中任一項所述的載體連接，得到環狀DNA的步驟；

(c)采用通過步驟(b)得到的環狀DNA對宿主細胞進行轉化的步驟；以及

(d)利用沒有缺失的耐藥性基因產物對其示出耐藥性的藥劑進行藥劑選擇，由此選擇具有環狀DNA的轉化體的步驟，其中所述環狀DNA是通過將PCR產物沿期望方向插入載體而成的；

其中，所述第一引物在3′末端側具有與前述DNA互補的核酸序列，并且當權利要求1～6中記載的載體中的活性喪失耐藥性基因是缺失了對耐藥性基因產物的C末端部分的氨基酸進行編碼的核酸序列的基因時，所述第一引物在5′末端側具有所缺失的核酸序列，當權利要求1～6中記載的載體中的活性喪失耐藥性基因是缺失了對耐藥性基因產物的N末端部分的氨基酸進行編碼的核酸序列的基因時，所述第一引物在5′末端側具有從所缺失的核酸序列的互補鏈序列脫除了5′末端的脫氧胸腺嘧啶核苷后的核酸序列。

8.權利要求7所述的克隆方法，其中步驟(a)中的DNA聚合酶具有在反應產物的3′末端以非模板依賴性的方式添加1個脫氧腺苷堿基的活性。

9.權利要求7所述的克隆方法，其中，在步驟(a)中還包括在反應產物的3′末端添加1個脫氧腺苷堿基的步驟。

10.一種載體的制造方法，包括下列步驟：通過限制性酶PmaCI切斷具有序列表的序列號19中記載的核酸序列的環狀雙鏈DNA的步驟；以及通過具有末端脫氧核苷酸轉移酶活性的酶，在切斷后的雙鏈DNA的兩個3′末端添加突出的1個脫氧胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶核苷殘基從而得到權利要求1中所述的載體的步驟。

11.一種試劑盒，其為克隆用試劑盒，含有權利要求1～6中任意一項所述的載體以及DNA連接酶。