[發(fā)明專利]制備聚乙二醇化堿性成纖維細胞生長因子的方法有效

申請?zhí)枺?/td>	201110261405.7	申請日：	2011-09-06
公開（公告）號：	CN102329395A	公開（公告）日：	2012-01-25
發(fā)明（設計）人：	黃志鋒;李校堃;葉朝輝;王曉杰;張翼;唐璐	申請（專利權）人：	溫州醫(yī)學院;黃志鋒
主分類號：	C07K17/08	分類號：	C07K17/08
代理公司：	溫州甌越專利代理有限公司 33211	代理人：	李友福
地址：	325035***	國省代碼：	浙江;33
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摘要：
搜索關鍵詞：	制備聚乙二醇堿性纖維細胞生長因子方法
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【說明書】：

技術領域

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)修飾制備領域，具體而言，本發(fā)明涉及完全在色譜柱上制備堿性成纖維細胞生長因子的方法。?

背景技術

堿性成纖維細胞生長因子（basic?fibroblast?growth?factor,?bFGF）是FGF家族的一個成員，是一種來源于中胚層及神經(jīng)外胚層的細胞因子，在人體組織包括皮膚、血管、神經(jīng)纖維、骨組織和軟骨組織等細胞上含有豐富的受體，具有廣泛的促進生長等方面的活性，它可以促進血管內(nèi)皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞和神經(jīng)纖維等細胞的生長，在臨床上具有巨大的應用價值。?

但大量研究和臨床實踐表明，bFGF在體內(nèi)作用的發(fā)揮需持續(xù)長時間與靶細胞受體結合，但bFGF存在穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短以及存在免疫原性等缺陷日益成為制約bFGF藥物廣泛應用的工程化瓶頸問題。因此可以通過聚乙二醇（PEG）化來提高bFGF穩(wěn)定性、延長其體內(nèi)半衰期。?

常規(guī)的聚乙二醇化bFGF是在液相環(huán)境中使得PEG與bFGF綴合，然后通過諸如色譜柱等純化。在綴合過程中，液相條件不太穩(wěn)定，容易在修飾過程中使蛋白失去活性，形成二聚體等，而且PEG-bFGF本身的層析峰較品平緩而且保留時間較短，這些多聚化的PEG-bFGF也會存在于這些峰中從而影響均一性；修飾位點不好控制，容易形成隨機、多位點修飾，結果導致產(chǎn)物不均一性能不穩(wěn)定；分離純化比較困難：往往需要多個步驟才能將單位點修飾產(chǎn)物和多位點修飾的產(chǎn)物分離開。?

為此，本發(fā)明人經(jīng)過大量研究，從眾多的修飾和純化的步驟和材料中選擇并組合出了完全在色譜柱上修飾堿性成纖維細胞生長因子并純化的方法，可以節(jié)約液相綴合步驟，而且所有步驟和材料均與該方法相適應，從而使得該方法能夠得以實現(xiàn)。該bFGF經(jīng)固相PEG修飾后得到的產(chǎn)物均一性好、分離純化工藝簡單，且修飾產(chǎn)物不但保留了很好的生物學活性，同時其熱穩(wěn)定性和抗酶解能力顯著提高、體內(nèi)半衰期顯著延長、免疫原性低顯著降低，從而可以推廣產(chǎn)業(yè)化。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術問題在于提供完全在色譜柱上修飾堿性成纖維細胞生長因子并純化的方法。?

???????具體而言，本發(fā)明提供了在色譜柱上制備聚乙二醇化堿性成纖維細胞生長因子（PEG-bFGF）的方法，其包括，?

（1）將bFGF溶液上樣于肝素-Sepharose親和層析柱；

（2）用mPEG-丁醛溶液在避光狀態(tài)下沖洗肝素-Sepharose親和層析柱；

（3）用低鹽緩沖液洗去肝素-Sepharose親和層析柱中的雜質(zhì)；

（4）用高鹽緩沖液對肝素-Sepharose親和層析柱洗脫，收集含PEG-bFGF的流出液；

（5）將步驟（4）獲得的流出液上樣于分子篩層析柱，并用低鹽緩沖液洗脫，收集含PEG-bFGF的流出液；和

（6）將步驟（5）獲得的流出液上樣于陽離子交換層析柱，收集用含NaCl的緩沖液洗脫的流出液。

優(yōu)選本發(fā)明的方法，其中步驟（5）中的分子篩層析柱是Sephadex?G-25層析柱。?

優(yōu)選本發(fā)明的方法，其中步驟（6）中的陽離子交換層析柱是SP-Sepharose陽離子交換層析柱。?

優(yōu)選本發(fā)明的方法，其中低鹽緩沖液是10~30mM磷酸緩沖液，優(yōu)選是20mM磷酸緩沖液。?