[發(fā)明專利]中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110261184.3
• 申請日: 2011-08-30
• 公開（公告）號: CN102334450A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張笑逸
• 申請（專利權(quán)）人: 張笑逸
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 紅河州專利事務(wù)所 53102
• 代理人: 朱躍平

技術(shù)領(lǐng)域??本發(fā)明是一種中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法。

背景技術(shù)??中國地生蘭花種子極細(xì)，細(xì)如塵埃，種子內(nèi)僅有一個發(fā)育不完全的胚，沒有胚芽和胚乳，不具備種子的基本結(jié)構(gòu)，沒有供其萌發(fā)的營養(yǎng)物質(zhì)，還不能稱其為種子，只能稱其為原生細(xì)胞胚，加之有一層翅羽狀種皮，種皮不易吸收水分，如蓮瓣蘭種子泡在水中三年以上也不能吸收到水分和外部提供的營養(yǎng)物質(zhì)，在自然界中必須靠某種真菌菌絲穿透其種皮為其提供營養(yǎng)才能誘發(fā)根狀莖龍根，不同的蘭花所需的真菌各不相同，人們至今未能分離到能作用于中國蘭花的真菌，各科研機(jī)構(gòu)經(jīng)過多年研究，僅僅分離到可供腐生蘭天麻萌發(fā)的小菇真菌，和供其生長所需的密環(huán)菌。所以，人工繁殖天麻得以成功，其他蘭花還不能自然繁殖。用常規(guī)方法播種不能萌發(fā)，故需要人工突破種皮后再由培養(yǎng)基來供給養(yǎng)份才能使原生細(xì)胞胚萌發(fā)，突破種皮現(xiàn)有技術(shù)是用氫氧化鈉溶液或酸溶液來浸泡腐蝕種皮，破皮后氫氧化鈉溶液或酸溶液同時也腐蝕了細(xì)胞胚，使其失活，難以控制得恰到好處，成功率極低，在加上中國地生蘭花不能誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖，而是在未知真菌作用下偶然產(chǎn)生根狀莖龍根，龍根在底下潛伏生長多年后形成龍根蛋或龍根球后，才分化出蘭花實(shí)生苗，人工誘導(dǎo)根狀莖龍根目前是個技術(shù)難題，此技術(shù)以前一直以日本、臺灣領(lǐng)先，經(jīng)數(shù)十年研究，國內(nèi)外有個別成功啟動的報道但很難實(shí)現(xiàn)重復(fù)成功啟動，再加上啟動根狀莖龍根成功率極低，一直以來未能達(dá)到批量生產(chǎn)目的，洋蘭(如大花蕙蘭和蝴蝶蘭)不產(chǎn)生根狀莖，直接由莖尖組織或種子產(chǎn)生原球莖，即可分化出從生芽，培養(yǎng)比較簡單所以日本、臺灣早已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，出口至世界各地賺取了大量外匯，而幽香高潔、號稱“王者之香”的中國地生蘭花至今不能產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，因此在物以稀為貴的原因下，前幾年有人將國蘭炒到了幾十萬、甚至幾百萬一苗的天價，損害蘭花愛好者的利益。本發(fā)明旨在突破國蘭產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)瓶頸，并取得了成功。

發(fā)明內(nèi)容??本發(fā)明的目的是提出一種中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，該方法能夠有效破解中國地生蘭花果實(shí)中細(xì)胞胚的種皮，同時又不損傷細(xì)胞胚本身，使細(xì)胞胚能吸收到周圍營養(yǎng)和水分，細(xì)胞能分化發(fā)育成種苗，并且有高的細(xì)胞胚啟動率，以此解決現(xiàn)有技術(shù)的難題。

本發(fā)明提出的這種中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于它有如下步驟：

(1)蝸牛酶消化酶的提取：從田間收集活的大蝸牛，饑餓兩天后用水沖洗干凈，輕輕敲碎，并小心剝?nèi)ネ鈿ぃ樝兰糸_體壁，剝離出消化道，從嗉囊和胃里抽取棕色消化液，用離心機(jī)以離心分層后，留上清液，棄掉沉淀物，用無菌濾膜注射器過濾純凈上清液待用；

(2)細(xì)胞胚預(yù)處理：選用尚未開裂的蘭花果實(shí)，表面用75％的酒精滅菌后，用10％次氯酸鈉浸泡5～10分鐘，用無菌水沖洗3次完成表面消毒后，在無菌操作臺上切開果子，將其中的原生細(xì)胞胚粉粒倒入置于100毫升消化酶溶液中25℃度浸泡30-50分鐘，用滴管吸取少量含有細(xì)胞胚粉粒的液體在相差顯微鏡下觀察，在顯微鏡下觀察到翅羽狀種皮開始降解時，立即停止浸泡并用無菌水沖洗至少3次，用濾紙過濾原生細(xì)胞胚粉粒；

(3)稀釋：將過濾出的細(xì)胞胚粉粒放入啟動有絲分離液體營養(yǎng)液中稀釋；

(4)接種：將第(3)步含有細(xì)胞胚粉粒的液體培養(yǎng)液接種于試管中的基礎(chǔ)固體營養(yǎng)基上；

(5)暗培養(yǎng)：接種好的試管在25℃恒溫狀態(tài)下在旋轉(zhuǎn)床上震蕩暗培養(yǎng)，直到可觀察到細(xì)胞胚粉粒開始膨大，細(xì)胞胚有絲分離開始；

(6)光照培養(yǎng)：此時轉(zhuǎn)為在1300LX光強(qiáng)下每天照射12h光照培養(yǎng)，恒溫25℃條件下靜置培養(yǎng)，直到可觀察到白色細(xì)胞團(tuán)膨大至1-3mm，顏色轉(zhuǎn)綠，在下部長出白色生長點(diǎn)1-6個，逐漸向下鉆入固體營養(yǎng)基，此時已完成了試管內(nèi)蘭花根狀莖(又名“龍根”)啟動過程；

(7)分化：將根狀莖轉(zhuǎn)接于分化固體營養(yǎng)基中生長點(diǎn)朝下插入營養(yǎng)基，25℃光強(qiáng)2000LX條件下，培養(yǎng)60d左右生長點(diǎn)開始不斷向下生長至2-3cm，根狀莖開始轉(zhuǎn)向折頭向上生長，直至鉆出固體營養(yǎng)基表面，這時生長點(diǎn)分化為芽點(diǎn)并長出子葉；

(8)生根：將根狀莖轉(zhuǎn)接于壯苗生根固體營養(yǎng)基上，芽點(diǎn)朝上根狀莖朝下，25℃光強(qiáng)2500LX條件下培養(yǎng)60d，根狀莖與子葉交界處長出肉質(zhì)氣生蘭根，子葉中心長出完整蘭花苗；

(9)煉苗移栽：將蘭花苗連龍根一起從試管中移出，洗凈根部附著的營養(yǎng)基，用1/1000濃度的多菌靈消毒后，晾干至氣生根發(fā)白時，移栽至經(jīng)高溫消毒的腐質(zhì)基質(zhì)中。

第(1)步的消化酶上清液，現(xiàn)取現(xiàn)用，間隔不超過一天，以保持其活性。