[發(fā)明專利]中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110261184.3
• 申請日: 2011-08-30
• 公開（公告）號: CN102334450A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張笑逸
• 申請（專利權(quán)）人: 張笑逸
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 紅河州專利事務(wù)所 53102
• 代理人: 朱躍平

1.一種中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于它有如下步驟：

(1)蝸牛酶消化酶的提取：從田間收集活的大蝸牛，饑餓兩天用水沖洗干凈，敲碎，小心剝?nèi)ネ鈿ぃ樝兰糸_體壁，剝離出消化道，從嗉囊和胃里抽取棕色消化液，用離心機(jī)離心分層，留上清液，棄掉沉淀物，過濾純凈上清液待用；

(2)細(xì)胞胚預(yù)處理：選用未開裂的蘭花果實(shí)，表面用75％的酒精滅菌，用10％次氯酸鈉浸泡5～10分鐘，取出用無菌水沖洗3次完成表面消毒，切開果子，將其中的原生細(xì)胞胚粉粒倒入消化酶溶液中25℃度浸泡30-50分鐘，翅羽狀種皮開始降解時，停止浸泡，用無菌水沖洗至少3次，用濾紙過濾原生細(xì)胞胚粉粒；

(3)稀釋：將過濾出的細(xì)胞胚粉粒放入啟動有絲分離液體培養(yǎng)基中稀釋；

(4)接種：將第(3)步含有細(xì)胞胚粉粒的液體培養(yǎng)液接種于試管中的基礎(chǔ)固體營養(yǎng)基上：

(5)暗培養(yǎng)：接種好的試管在25℃恒溫狀態(tài)下，在旋轉(zhuǎn)床上震蕩暗培養(yǎng)，直至可觀察到細(xì)胞胚粉粒開始膨大，細(xì)胞胚有絲分離開始；

(6)光照培養(yǎng)：接上步，此時轉(zhuǎn)為在1300LX光強(qiáng)下，每天照射12h光照培養(yǎng)，恒溫25℃條件下靜置培養(yǎng)，直到試管內(nèi)蘭花根狀莖(龍根)啟動；

(7)分化：將根狀莖轉(zhuǎn)接于分化固體營養(yǎng)基中，生長點(diǎn)朝下插入營養(yǎng)基，25℃光強(qiáng)2000LX條件下，培養(yǎng)60d左右生長點(diǎn)開始不斷向下生長至2-3cm，根狀莖開始轉(zhuǎn)向折頭向上生長，直至鉆出固體營養(yǎng)基表面，這時生長點(diǎn)分化為芽點(diǎn)并長出子葉；

(8)生根：將根狀莖轉(zhuǎn)接于壯苗生根固體營養(yǎng)基上，芽點(diǎn)朝上根狀莖朝下，25℃光強(qiáng)2500LX條件下培養(yǎng)60d，根狀莖與子葉交界處長出肉質(zhì)氣生蘭根，子葉中心長出完整蘭花苗；

(9)煉苗移栽：將蘭花苗連龍根一起從試管中移出，洗凈根部附著的營養(yǎng)基，用1/1000濃度的多菌靈消毒后，晾干至氣生根發(fā)白時，移栽至經(jīng)高溫消毒的腐質(zhì)基質(zhì)中。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于第(1)步的消化酶上清液，現(xiàn)取現(xiàn)用，間隔不超過一天，以保持其活性。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于第(2)步的消化酶溶液配方是：蝸牛消化酶上清液30ml，山梨醇0.1g，pH值調(diào)至5.8，無菌水稀釋至100ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于第(3)步的啟動有絲分離液體培養(yǎng)基配方是：N6+蔗糖20g+6BA2.0mg+NAA0.2mg+香蕉提取液100ml+活性碳2g。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于第(4)步的基礎(chǔ)固體營養(yǎng)基配方是：1/4MS+馬鈴薯泥50g+活性碳3g+強(qiáng)度為1300的瓊脂粉3.2g。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于第(7)步的分化固體營養(yǎng)基配方是：1/4MS+6BA0.5mg+NAA0.5mg+馬鈴薯泥100g+活性碳3g+強(qiáng)度為1300的瓊脂粉3.7g。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于第(8)步的壯苗生根固體營養(yǎng)基配方：1/2MS+6BA0.2mg+IBA2.5mg+馬鈴薯泥100g+香蕉泥100g+活性碳3g+強(qiáng)度為1300的瓊脂粉3.7g。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于第(5)步暗培養(yǎng)的時間為70-90天，一般以80天為宜。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國地生蘭花原生細(xì)胞胚消化酶干預(yù)培養(yǎng)法，其特征在于第(6)步的培養(yǎng)天數(shù)為40-60天，以50天為宜。