[發明專利]一種基于假attP位點整合的通用型表達載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201110259942.8
• 申請日: 2011-09-05
• 公開（公告）號: CN102321655A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 余源;張涌;郭澤坤;王勇勝;田進海;胡廣東;蘇峰;劉軍
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學;楊凌科元克隆股份有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N5/10
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及一種位點特異性整合的表達載體，特別涉及一種基于假attP位點整合的通用型表達載體及其構建方法和應用。

背景技術

轉基因動物的研究現在正是科學研究中的熱點。通過轉基因技術，人們可以打破種間隔離獲得具有優良性狀的經濟動物，可以通過生產生物反應器獲得各種生物材料和藥用蛋白，可以打破免疫排斥進行器官移植，可以建立各種人類疾病的動物模型以及分析研究特定基因功能。然而，現有的轉基因動物生產技術仍然存在一定弊端：外源基因的隨機插入帶來的位置效應，即外源基因隨機插入到與細胞重要生命活動相關的基因內部引起其異常表達，或者外源基因插入異染色質區造成外源基因表達沉默。

近年來，鏈霉菌噬菌體φC31整合酶能夠催化鏈霉菌基因組中的attB位點和噬菌體基因組attP位點之間的同源重組引人關注[Kuhstoss?S，Rao?RN.Analysis?of?the?integration?function?of?the?streptomycete?bacteriophageφC31.JMol?Biol，1991，222(4)：897-908.]。φC31整合酶介導的重組具有單向整合、無需外界化學能源和輔助因子、勝任大片段基因有效整合、可在多種高等植物和動物細胞中發揮作用及外源基因可長期高效表達等特點[Calos?MP.TheφC31integrase?system?for?gene?therapy.Curr?Gene?Ther，2006，6(6)：633-645.]，已經成為繼Cre重組酶和FLP重組酶之后的又一種基因修飾的有力工具，越來越多的用于轉基因研究。

而有關假attP位點在基因組分布規律方面的研究表明，假attP位點多位于基因間或基因內含子內，整合很少發生在基因的外顯子中[Thyagarajan?B，Liu?Y，Shin?S，Lakshmipathy?U，Scheyhing?K，Xue?H，C，Strehl?R，Hyllner?J，Rao?MS，Chesnut?JD.Creation?of?engineered?human?embryonic?stem?cell?lines?usingφC31integrase.Stem?Cells，2008，26(1)：119-126.]。這種偏向于轉錄活躍區的整合有利于基因的表達，這有可能是整合酶介導的整合與隨機整合相比普遍有較長時間高水平表達的原因[Calos?MP.TheφC31integrase?system?for?gene?therapy.Curr?Gene?Ther，2006，6(6)：633-645.]。而且，整合位點不偏好于轉錄起始位點[Chalberg?TW，Portlock?JL，Olivares?EC，Thyagarajan?B，Kirby?PJ，Hillman?RT，Hoelters?J，Calos?MP.Integration?specificity?of?phage?φC31integrase?in?the?human?genome.J?Mol?Biol，2006，357(1)：28-48.]，Sivalingam等[Sivalingam?J，Krishnan?S，Ng?WH，Lee?S?S，Phan?TT，Kon?OL.Biosafety?assessment?of?site-directed?transgene?integration?in?human?umbilical?cord-lining?cells.Mol?Ther，2010，18(7)：1346-1356.]發現，超過70％的整合位點位于轉錄起始位點50kb以外。因此，從這方面來講，φC31整合酶介導的整合潛在的安全隱患較隨機插入和病毒載體系統要小的多。

體細胞核移植技術作為轉基因動物生產的有效有段，其突出優點是將基因轉移提前到體細胞培養階段，可以有效的提高轉基因動物的出生率和控制生產成本[M.B.Wheeler?and?E.M.Walters.Transgenic?technology?and?applications?in?swine.Theriogenology2001，56(8)：1345-1369]，但是核供體細胞的準備一般需要經過藥物篩選，而最終轉基因細胞中抗生素篩選標記的殘留，對轉基因動物安全及環境安全造成了潛在的威脅。