[發明專利]一種基于假attP位點整合的通用型表達載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201110259942.8
• 申請日: 2011-09-05
• 公開（公告）號: CN102321655A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 余源;張涌;郭澤坤;王勇勝;田進海;胡廣東;蘇峰;劉軍
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學;楊凌科元克隆股份有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N5/10
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 陸萬壽

1.一種基于假attP位點整合的通用型表達載體，其特征在于，包括attB序列、pUC?ori和多克隆位點MCS，CMV組成型啟動子與attB序列相連接，CMV組成型啟動子下游插入兩個同向的LoxP元件，在LoxP元件下游設有第一熒光指示蛋白開放閱讀框及其終止子，在兩個LoxP元件之間設有第二熒光指示蛋白開放閱讀框及其終止子和抗生素篩選元件。

2.如權利要求1所述的基于假attP位點整合的通用型表達載體，其特征在于，所述的attB序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述的CMV組成型啟動子為Pcmv?IE啟動子。

3.如權利要求1所述的基于假attP位點整合的通用型表達載體，其特征在于，所述的多克隆位點MCS包括以下限制性內切酶識別位點：

MluI、BamHI、PacI、PspOMI、SacI、FseI、AclI、XhoI、PvuI、KpnI、HindIII、BglII和EcoRI。

4.如權利要求1所述的基于假attP位點整合的通用型表達載體，其特征在于，所述的兩個同向的LoxP元件及其內外側酶切識別位點的序列如SEQ.ID.NO.2所示。

5.如權利要求1所述的基于假attP位點整合的通用型表達載體，其特征在于，所述的第一熒光指示蛋白開放閱讀框為綠色熒光蛋白eGFP開放閱讀框，第二熒光指示蛋白開放閱讀框為紅色熒光蛋白DsRed開放閱讀框，其終止子均為Sv40終止子。

6.如權利要求1所述的基于假attP位點整合的通用型表達載體，其特征在于，所述的抗生素篩選元件為KanR/neoR表達元件，兩個LoxP元件之間以還設有一個阻止CMV組成型啟動子對第一熒光指示蛋白泄漏表達的Sv40終止子。

7.一種基于假attP位點整合的通用型表達載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)通過SOE-PCR方法，克隆獲得如SEQ.ID.NO.1所示的兩端含有AseI酶切位點及保護堿基的attB序列；

2)通過SOE-PCR方法，克隆獲得如SEQ.ID.NO.2所示的兩個同向的LoxP元件及其內外側酶切識別位點的LoxP2序列；

3)通過SOE-PCR方法，克隆獲得如SEQ.ID.NO.3所示的包含多個克隆位點的MCS序列；

4)用BamHI/BglII雙酶切pEGFP-C1載體，凝膠回收載體骨架片段并連接后，獲得pEGFP-B2載體；

通過AseI酶切位點將attB序列克隆入pEGFP-B2載體獲得pAttB-eGFP載體；

通過NheI/AgeI酶切位點將LoxP2序列克隆入pAttB-eGFP載體獲得pAttB-Loxp2-eGFP載體；

5)通過SpeI/AflII酶切位點，將包含KanR/neoR基因開放閱讀框、表達KanR基因的原核啟動子、表達neoR基因的SV40早期啟動子及HSV?TKpolyA終止子的KanR/neoR表達元件，克隆入pAttB-Loxp2-eGFP載體中得到pAL2G-neo載體；

然后再通過AflII/NotI酶切位點將Sv40pA終止子克隆入pAL2G-neo載體，得到pAL2G-neopA載體；

6)用MluI/EcoO109I分別雙酶切MCS序列和pAL2G-neopA載體，凝膠回收酶切后的片段，然后將回收的片段連接后得到pANG-MCS載體；

7)通過AscI/SpeI酶切位點將DsRed1開放閱讀框及其終止子序列克隆入pANG-MCS載體，得到基于假attP位點整合的通用型表達載體pARNG。

8.權利要求1所述的基于假attP位點整合的通用型表達載體在篩選穩定表達熒光標記蛋白的無抗生素篩選標記的重組細胞的應用。

9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，基于假attP位點整合的通用型表達載體在進行細胞轉染之后，進行藥物篩選，獲得表達載體穩定轉染的重組細胞；然后對其進行Cre重組剪切LoxP序列的處理，篩選穩定表達第一熒光蛋白的重組細胞，獲得表達熒光標記蛋白的無抗生素篩選標記的重組細胞。

10.如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述的Cre重組剪切LoxP序列的處理為：

對藥物篩選后的重組細胞進行包含Cre元件的表達載體的轉染，或者將其在含有連接有穿膜肽的Cre重組酶的環境中進行孵育。