[發明專利]一種華重樓根莖的慢速冷凍保存方法

有效

• 申請號: 201110259181.6
• 申請日: 2011-09-02
• 公開（公告）號: CN102258010A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 王躍華;田夢良;林抗雪;劉益麗;張玨;李文光;馬良良;張紅玉;陳燕;湯有舉
• 申請（專利權）人: 成都大學
• 主分類號: A01N3/00
• 分類號: A01N3/00
• 代理公司: 成都科奧專利事務所(普通合伙) 51101
• 代理人: 王蔚

技術領域

本發明涉及一種植物種質資源的超低溫冷凍保存方法，特別是涉及一種華重樓根莖的慢速冷凍保存方法。

背景技術

中國藥典規定的中藥重樓為滇重樓(Paris?polyphylla?var.yunnanensis)和華重樓(Paris?polyphylla?var.chinensis)的地下莖，前者主產于云南，后者主產于四川。《神農本草經》最早記載的蚤休即華重樓。重樓具有清熱解毒、消炎止痛、活血化淤、涼肝定驚的功效，是重要的配方藥。

近年來重樓因其具有抗病毒、抗腫瘤作用而需求量大增，價格快速上揚。重樓中藥材歷來以野生資源提供藥用，近年來由于對野生資源地過度采挖，致使野生重樓資源遭到了毀滅性的破壞，現已瀕臨滅絕。為了更好的保護華重樓野生種質資源，本發明開展了對華重樓地下莖的超低溫保存技術的研究。

慢速冷凍法是一種應用時間較長、保存效果較好的超低溫冷凍保存方法，它是以保護性脫水為理論基礎而建立的冷凍保存方法；該方法是通過在程序性降溫儀中完成對冷凍保存材料的逐步降溫處理，使材料細胞內的水分充分脫出，從而有效地避免保存材料在冷凍過程中因細胞內大量水分產生冰晶而造成對保存材料的危害。然而由于該方法在實際操作過程中必須要使用昂貴的程序性降溫儀才能完成對保存材料的逐級降溫處理，具體操作需要在程序性降溫儀中完成以每分鐘1-2℃的降溫速度將保存材料從0℃逐漸降到-100℃左右，最后再將材料投入液氮中進行保存。因此，常規的慢速冷凍保存方法一方面必須要使用昂貴的程序性降溫儀，另一方面整個冷凍保存過程需花費較長的時間；并且常規的慢速冷凍法所使用的冷凍保護劑大多為有機試劑，也不利于中藥材種質材料的保存。

發明內容

本發明針對現有保存方法存在的問題而提供一種華重樓根莖的慢速冷凍保存方法，該方法采用無任何毒副作用的脫脂奶粉作為保護劑，并以普通冰箱取代了原本必須使用的昂貴程序性降溫儀。

為達到上述目的，本發明采用的解決方法包括下列步驟：

(1)預處理：取華重樓根莖，先在4～8℃條件下放置15～20天，然后切成5～20mm3的塊狀，再置于預培養液：蔗糖4～7％+脯氨酸0.2～0.5％中預培養20～24小時；

(2)冷凍處理：將預培養后的華重樓根莖放入裝有保護劑的冷凍管中，先置于2℃冰箱中放置30～40min，然后再移置于-16℃的冰箱中并開始逐漸降溫，待溫度降至-24℃后放置30～60min，隨即迅速投入液氮中進行保存，所述保護劑為：脫脂奶粉30～40％+脯氨酸1.0～1.5％；

(3)解凍以及洗滌：華重樓根莖在液氮中保存至少1周后，當需要使用根莖時，將冷凍管取出，迅速放入恒溫培養箱內進行快速解凍，解凍完畢后，用0.4～0.5mol/L的蔗糖溶液進行浸泡洗滌3～4次，每次10～15min，最后用蒸餾水沖洗干凈。

上述步驟(3)中恒溫培養箱的溫度為40～60℃。

解凍后的重樓根莖細胞的存活率可通過如下方法進行檢測：將洗滌后的華重樓根莖用pH為7.0的0.4％TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)溶液于25℃暗處染色18h，然后倒去TTC溶液，加入無水乙醇于40℃恒溫水浴鍋中進行TTF的提取直至材料無色，取上清液于485nm處測定吸光值，并計算凍后材料細胞相對存活率，細胞相對存活率％＝處理后材料的吸光值/未處理材料的吸光值X?100％，所采用的TTC溶液是用TTC物質在pH為7.0的磷酸緩沖溶液中配制而成的，配制濃度為0.4％。

本發明采用了無任何毒副作用的脫脂奶粉作為保護劑，實現了名貴中藥材的綠色保存；脫脂奶粉作為非滲透性保護劑雖不能進入細胞內，但它可溶解于細胞之間的組織液中以增高組織液的濃度，從而使得細胞內液與組織液間形成滲透壓差，可有效地促使細胞內水分的脫出，以減少細胞內自由水的含量，從而可避免材料在冷凍保存過程中由于細胞內冰晶的形成而造成對細胞的傷害。同時，本發明實現了在普通冰箱中順利完成冷凍保存過程的降溫操作，真正擺脫了常規慢速冷凍保存方法對昂貴程序性降溫儀的依賴性，大大地降低了材料冷凍保存的時間和成本。

下面結合實施例對本發明做進一步詳細說明，但本發明的內容并不僅限于此。

具體實施方式

實施例1

(1)預處理：選取生長5年以上且生長健康的華重樓根莖，先在4℃條件下放置20天，然后切成15mm³的塊狀，再置于預培養液：蔗糖7％+脯氨酸0.5％中預培養24小時；