[發明專利]FXYD6胞內區蛋白的表達和純化方法

無效

• 申請號: 201110259079.6
• 申請日: 2011-09-02
• 公開（公告）號: CN102978210A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 周寧新
• 申請（專利權）人: 周寧新
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;C12N15/11;C12N1/21;C07K14/47;C07K1/22
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司 11100
• 代理人: 王淳

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地，涉及FXYD6胞內區蛋白的表達與純化。

背景技術

FXYD6基因定位于11號染色體長臂(11q23.3)，FXYD6蛋白是FXYD家族新成員，全稱為包含FXYD結構域的轉運調節因子6(FXYD?domain-containing?ion?transport?regulator?6)。它屬于單跨膜蛋白，其結構包含有細胞外固定的FXYD序列的單跨膜片段，為離子通道或離子通道調節器。FXYD6蛋白作為膜蛋白的功能區分布：信號肽位于第1-18aa，胞外區位于19-38aa，跨膜區位于39-56aa，57-95aa是胞內區。

FXYD6對于大鼠生后和成熟大腦的神經元的興奮性有很大的作用，然而在FXYD6與精神分裂癥的易感性的相關性方面的研究，美國、日本和中國的研究者得出的結論不一致。近期的研究顯示：FXYD6蛋白通過調節Na⁺-K⁺-ATPase的活性，有助于產生和維持內淋巴的內耳蝸勢能和保證離子成分穩定，有助于內耳聽神經的平衡功能。

有關FXYD6與腫瘤關系的研究鮮見報道，但FXYD家族突變或缺失很可能引起嚴重病理變化。國內周寧新教授領導的課題小組在對FXYD6與腫瘤的關系方面做了深入的研究，首先從不同分化膽管癌組織中分離得到的差異表達的L2cDNA片段，反向Northern雜交證實它在正常膽管組織低表達，在膽管癌組織中高表達，且在不同分化膽管癌組織中表達差異顯著，在低分化膽管癌中高表達，而高分化膽管癌中相對低表達。FXYD6?unigene拼接序列中包含L2cDNA，與定位于11q23.3的FXYD基因家族中的新基因FXYD6高度同源(同源性98.90％)，并從組織cDNA文庫(肝、腦)獲得FXYD6基因全長序列。隨后又在基因和蛋白水平上對FXYD6在膽管癌組織表達進行了研究，發現人FXYD6基因在RNA水平上，在正常膽管、膽管癌中均存在表達，基因的表達量在正常膽管與膽管癌之間存在明顯差異，與膽管癌分化程度呈負相關。體外實驗證實，人FXYD6反義核酸可明顯抑制人膽管癌細胞細胞(QBC939)的體外增殖能力。出現上述研究結果的可能原因為FXYD6基因定位于11號染色體長臂(11q23.3)，而11號染色體長臂是包括膽管癌、胰腺癌、肝癌在內的多種腫瘤細胞最常見的異常區。因此表達并純化FXYD6蛋白，進而制備FXYD6蛋白的單克隆抗體，可以為研究該分子在大腦組織中的具體功能和一些腫瘤發生及進展過程中的分子作用機制提供重要的工具。檢測該分子在不同組織中的分布情況，定量檢測FXYD6蛋白也有助于我們對一些腫瘤的早期診斷及鑒別診斷。

發明內容

本發明的主要目的是提供一種經過純化的FXYD6胞內區蛋白，為研究該分子在大腦組織中的具體功能和一些腫瘤發生及進展過程中的分子作用機制提供工具。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種FXYD6胞內區蛋白的表達和純化的方法，其步驟如下：

a.采用核苷酸序列如SEQ?ID?No：2和SEQ?ID?No：3所示的引物對，利用PCR技術擴增FXYD6胞內區基因；

b.將擴增出的FXYD6胞內區基因插入到已用BamH?I和Xho?I雙酶切后的表達載體pGEX-6P-1中，構建重組載體pGEX-6P-1-FXYD6胞內區；

c.將重組載體pGEX-6P-1-FXYD6胞內區轉化于宿主細胞中，并在宿主細胞中表達FXYD6胞內區蛋白；

d.表達的FXYD6胞內區蛋白采用蛋白質免疫印記(Western?Blot)進行鑒定，之后通過親和層析柱進行純化，經過純化的蛋白再通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析鑒定純度。

如上所述的方法，其中，所述宿主細胞優選為原核細胞。

如上所述的方法，其中，所述宿主細胞優選為大腸桿菌。

一對用于FXYD6胞內區蛋白的表達和純化的引物，其中，上游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No：2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ?ID?No：3所示。

一種可在宿主細胞中表達FXYD6胞內區蛋白的重組載體，其是采用核苷酸序列如SEQ?ID?No：2和SEQ?ID?No：3所示的引物對、利用PCR技術擴增FXYD6胞內區基因后，將擴增出的FXYD6胞內區基因插入到已用BamH?I和Xho?I雙酶切后的表達載體pGEX-6P-1中，所得到的重組載體。