[發(fā)明專利]一種埃博霉素B分子印跡聚合物的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110258996.2
• 申請日: 2011-09-02
• 公開（公告）號: CN102432753A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李慧;萬吉;龔國利;王學(xué)川
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西科技大學(xué)
• 主分類號: C08F222/14
• 分類號: C08F222/14;C08F220/06;C08F2/44;C08J9/26
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 王艾華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種生物化學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域的一種制備方法，具體涉及的是一種埃博霉素B分子印跡聚合物的制備方法。

背景技術(shù)

埃博霉素B(Epothilone?B)是粘細(xì)菌纖維堆囊菌(Sorangium?cellulosum)產(chǎn)生的一種聚酮次級代謝產(chǎn)物，它與臨床上廣泛應(yīng)用的抗腫瘤化療藥物紫杉醇(paclitaxel)具有相同的穩(wěn)定微管活性，且對紫杉醇耐藥的腫瘤細(xì)胞具有活性。

埃博霉素的發(fā)現(xiàn)可以追溯到上世紀(jì)八十年代德國國家生物技術(shù)研究中心(GBF)的微生物學(xué)家對土壤中粘細(xì)菌的大量研究工作。1987年他們在尋找抗真菌藥物時(shí)發(fā)現(xiàn)了一株粘細(xì)菌(Sorangium?cellulosum?So?ce90)能產(chǎn)生一類具有微弱抗真菌活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，命名為埃博霉素A和B。當(dāng)時(shí)這個(gè)化合物并沒有引起研究人員的重視。1995年默克實(shí)驗(yàn)室的研究人員發(fā)現(xiàn)了埃博霉素具有和紫杉醇類似的促微管聚合活性。從此，埃博霉素以其比紫杉醇更好的水溶性，更簡單的結(jié)構(gòu)，對紫杉醇抗性腫瘤細(xì)胞的高活性以及可以通過微生物發(fā)酵制備而迅速成為繼紫杉醇之后發(fā)現(xiàn)的促微管聚合化合物中最令人興奮的研究熱點(diǎn)。目前諾華、施貴寶、默克、羅氏等大型跨國制藥公司都在埃博霉素藥物的臨床研究上投入了大量的人力物力，施貴寶公司已有一個(gè)埃博霉素產(chǎn)品(Ixabepilone，商品名Ixempra，“伊沙匹隆”)上市，預(yù)期不久將有更多品種埃博霉素藥物上市。

目前埃博霉素生產(chǎn)成本很高，其中有兩個(gè)重要原因。第一是埃博霉素對生產(chǎn)菌株的毒性和反饋抑制作用較大程度導(dǎo)致埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量很難提高，這方面的困難雖然已經(jīng)依靠在發(fā)酵液中添加大孔吸附樹脂XAD-16得到一定的緩減，但樹脂對發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)的非特異性吸附為埃博霉素的產(chǎn)量提高又帶來許多新的困難。第二個(gè)導(dǎo)致埃博霉素生產(chǎn)成本高的原因是發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)物中存在大量埃博霉素同系物，導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物(例如：埃博霉素B)分離純化成本非常高。因此開發(fā)能特異性吸附特定埃博霉素類化合物的吸附劑用于它的發(fā)酵生產(chǎn)和分離提取中將極大降低埃博霉素藥物的生產(chǎn)成本。

分子印跡聚合物就是一種對特定分子具有專一識別性能的高分子材料，目前國內(nèi)外還未見關(guān)于埃博霉素分子印跡聚合物的研究報(bào)道。分子印跡技術(shù)(Molecularly?imprinted?technology，MIT)是受人們對抗原-抗體、酶-底物專一性識別的啟發(fā)而產(chǎn)生的。20世紀(jì)40年代，諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Pauling提出了以抗原為模板來合成抗體的設(shè)想，并試圖用鎖-匙理論來解釋免疫體系^[14]。盡管這一設(shè)想被后來的實(shí)的，但卻是對分子印跡技術(shù)最初的描述，并且其中兩點(diǎn)正確的假設(shè)為分子印跡技術(shù)的建立奠定了基礎(chǔ)：假定生物體所釋放的物質(zhì)與外來物質(zhì)有相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)；假定生物體所釋放的物質(zhì)與外來物質(zhì)在空間上相互匹配。本專利公布了一種埃博霉素B特異性吸附劑的制備技術(shù)，本發(fā)明可為埃博霉素藥物的生產(chǎn)成本降低奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種埃博霉素B分子印跡聚合物的制備方法。該聚合物可以選擇性地從發(fā)酵液中吸附埃博霉素B，從而實(shí)現(xiàn)埃博霉素B的分離純化，降低使用現(xiàn)有吸附劑的生產(chǎn)成本，提高專一性選擇吸附能力。該分子印跡聚合物可以用于液體發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素B，在發(fā)酵液中直接起到分離純化埃博霉素B的作用，也可以用于從發(fā)酵液中分離提取埃博霉素B和痕量埃博霉素B的檢測。

本發(fā)明中埃博霉素B分子印跡聚合物是通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，包括具體步驟如下：

(1)將模版分子埃博霉素B，功能單體，交聯(lián)劑按照摩爾比1∶4∶20混合均勻，溶解于5ml體積比為4∶1的乙腈和甲醇溶液中，攪拌均勻，加入引發(fā)劑偶氮二異丁氰5.0mg；

(2)通氮排氧20～30min，氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下封管，45℃水浴中聚合12-16小時(shí)，再在60℃水浴中聚合12-16小時(shí)得到反應(yīng)產(chǎn)物；

(3)將得到的產(chǎn)物聚合物破碎、研磨、過篩得到粒徑40～60μm的聚合物顆粒；

(4)將聚合物顆粒于體積比1∶9～3∶7乙酸和甲醇混合溶液中索氏萃取數(shù)次去除模板分子，冷凍干燥至恒重，得到埃博霉素B分子印跡聚合物。

所制備的埃博霉素B分子印跡聚合物為具有多孔結(jié)構(gòu)形態(tài)的疏松聚合物；

去除模版分子埃博霉素B的方法為索氏萃取法。

索氏萃取5次以上，每次萃取時(shí)間為6～8小時(shí)，最后需用甲醇再次萃取2次以上。