[發明專利]中國對蝦家系識別微衛星標記四重PCR引物與識別方法

無效

• 申請號: 201110258128.4
• 申請日: 2011-09-02
• 公開（公告）號: CN102399776A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 王偉繼;阮曉紅;李偉亞
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京中偉智信專利商標代理事務所 11325
• 代理人: 張岱

技術領域：

本發明屬于分子生物學遺傳育種的分子標記輔助技術，是一種中國對蝦家系識別微衛星標記四重PCR引物及利用該引物進行家系識別的方法。

背景技術：

中國對蝦(Fenneropenaeus?chinensis)又名東方對蝦、對蝦，是原產我國的一種優質海水養殖品種。利用分子標記輔助育種是中國對蝦良種選育重要途徑之一，目前應用最為廣泛的分子標記為微衛星。常規微衛星檢測技術為單對引物進行單個位點的PCR擴增，其產物利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測，效率低，周期長。微衛星多重PCR是基于常規PCR技術，在一個PCR反應體系中加入多對特異性的微衛星引物，針對特定模板進行多個微衛星目的片段的PCR技術。中國對蝦多重PCR檢測技術的特點是效率高、周期短，可以有效利用少量模板，提高微衛星標記中國對蝦遺傳多樣性分析、個體系譜識別及遺傳連鎖圖譜構建的效率。目前國內外尚未見有中國對蝦微衛星四重PCR技術的發明及相關報道。與本發明類似的專利申請有“中國對蝦微衛星三重PCR家系識別技術”(孔杰，高煥，授權公告號為：CN100510103C)。該專利將開發的三對中國明對蝦微衛星引物納入到一個PCR反應體系中，利用片段大小區分不同產物。其優點在于三重PCR提高了PCR檢測效率；缺點在于個體識別率有限，不同目的片段的PCR產物靠目測難以區分。

發明內容：

本發明要解決的技術問題是提供中國對蝦家系識別四重微衛星PCR引物，并利用不同中國對蝦微衛星位點擴增片段的大小差異，優化PCR反應條件，建立一個中國對蝦四重微衛星PCR反應及檢測體系，為中國對蝦分子標記輔助育種提供高效、準確的微衛星標記檢測技術。

本發明是通過如下技術方案實現的：

中國對蝦家系識別微衛星四重PCR引物的序列如下：

RS1101正向序列為：5′-CGAGTGGCAGCGAGTCCT-3′，反向序列為：5′-TATTCCCACGCTCTTGTC-3′；

FCKR005正向序列為：5′-CATCGAATCTAAGAGCTGGAAT-3′，反向序列為：5′-TTTGTTTGTGAATAATGTGTGT-3′；

FCKR007正向序列為：5′-CGAAATAAGTTAAATGAAAAAA-3′，反向序列為：5′-CAACATAAGACTCACGAGACAG-3′；

FCKR009正向序列為：5′-GCACGAAAACACATTAGTAGGA-3′，反向序列為：5′-ATATCTGGAATGGCAAAGAGTC-3′。

一種中國對蝦微衛星標記四重PCR家系識別方法，包括以下步驟：提取中國對蝦基因組DNA、加入上述中國對蝦微衛星標記四重PCR引物建立PCR反應體系，選擇合適的PCR反應程序進行擴增，PCR產物經常規聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染檢測方法進行中國對蝦四個微衛星位點分析，對中國對蝦不同家系進行區分或者進行個體間及親子之間的識別和鑒定；

所述的PCR反應體系，即四對引物可在同一個PCR反應體系中同時擴增的參數，這些參數是：10×PCR?Buffer?2.5μl(內含750mM?Tris-HCl(pH?8.8)，200mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween?20)，2.0mM?Mg²⁺，0.2mM?dNTP，四對引物正向及反向序列各0.2μM，1.0unitDNA聚合酶，模板DNA100ng，補充滅菌雙蒸水使PCR反應體系達到25μl；

所述的PCR反應程序為：95℃預變性4min，隨后的10個PCR循環為94℃變性40s、52℃退火1min、72℃延伸40s；緊跟著的4個循環為94℃變性40s、51℃退火1min、隨后每個循環的退火溫度降低0.5℃、72℃延伸1min；最后10個循環為94℃變性40s、49℃退火1min、72℃延伸1min。

本發明與現有技術相比的有益效果：