[發明專利]缺血模型多模態分子成像監測方法

有效

• 申請號: 201110258049.3
• 申請日: 2011-09-02
• 公開（公告）號: CN102389297A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 曹豐;劉俊廷;田捷;梁繼民;范偉偉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學;西安電子科技大學
• 主分類號: A61B5/00
• 分類號: A61B5/00;A61B6/03
• 代理公司: 西安新思維專利商標事務所有限公司 61114
• 代理人: 韓翎

一、技術領域：

本發明涉及到多模態分子成像技術領域，具體涉及一種缺血模型多模態分

子成像監測方法。

二、背景技術：

近年來，基于缺血型的小動物分子成像技術受到了廣泛關注，針對這一動物模型應用干細胞介導的缺血損傷修復和血管新生的研究已屢見不鮮。然而，對動物模型的干預效果監測手段目前主要有離體的免疫組化、免疫熒光等手段，對于干細胞在小動物體內的存活情況則需要通過移植來源于帶有綠色熒光蛋白(GFP)的轉基因動物的干細胞到損傷動物模型，干細胞的存活情況需要處死動物后獲取組織在顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白來進行鑒定（Katstural?Jetal,?Circulation?Research,?2005），在體觀察干細胞也有文獻報道采用生物發光成像（Bioluminescence?imaging,?BLI）技術對表達熒光素酶（luciferase）的干細胞進行觀測（Cao,?F.?et?al.?In?vivo?visualization?of?embryonic?stem?cell?survival,?proliferation,?and?migration?after?cardiac?delivery.?Circulation?113,?1005-1014,2006）；生物發光成像技術只能獲取二維的平面像，不能直觀地顯示小動物體內光源所處的三維空間位置信息，在可視化效果上有很大的局限性；在定量分析方面，生物發光成像只能進行相對的定量分析，不具有絕對定量的意義，可以參見：R.?Weissleder?and?M.?J.?Pittet,?Imaging?in?the?era?of?molecular?oncology,?Nature?452,?580-589?(2008).?另外，對小動物缺血模型還需要觀察干細胞干預后的血管新生情況，傳統的方法是取缺血區域的組織對血管內皮的標志分子CD31進行抗體染色，通過對照組和干預組比較血管新生的情況。這種方法需要在不同的階段處死動物模型，給實驗的連續觀測帶來了很大的不便。

三、發明內容：

本發明針對上述現有技術方法中對小動物缺血模型的干細胞干預過程中干細胞的存活和定位示蹤、以及血管新生的離體觀測方法的缺陷，提供一種缺血模型多模態分子成像監測方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：缺血模型多模態分子成像監測方法，其特征在于：所述的監測步驟為：

（1）穩定表達熒光素酶和綠色熒光蛋白的干細胞的分離和培養；

（2）構建缺血動物模型；

（3）移植步驟（1）中的培養的干細胞到步驟（2）所構建的動物模型的缺血損傷區域；

（4）在第1天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天用生物發光斷層成像系統進行成像，觀測時間點直到看不到發光的干細胞為止；從而可以定位干細胞在小動物體內存在的三維空間位置和示蹤干細胞的存活情況，通過干細胞定量方法觀測干細胞在體內不同時間點的存活數量；

（5）通過穩定表達綠色熒光蛋白的干細胞進行抗綠色熒光蛋白的抗體染色，處死動物模型并在注射干細胞的區域取肌肉組織制作冰凍切片，用熒光顯微鏡觀察標記綠色熒光蛋白的干細胞來做干細胞在缺血組織中的存在性驗證；

（6）在第1天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天用micro-CT成像系統對動物缺血模型的微血管網絡成像，觀測微血管網絡密度是否發生了變化；

（7）?由小動物缺血模型和干細胞移植后的不同時間點的干預組和對照組的血管鑄型、血管鑄型的電鏡掃描結果來驗證micro-CT對微血管網絡密度變化的成像結果以及驗證血管是否有發芽情況。

在步驟（1）中的干細胞是由穩定表達熒光素酶和綠色熒光蛋白的轉基因動物分離出來的，通過穩定表達熒光素酶在底物熒光素和氧以及三磷酸腺苷的作用下在動物體內產生生物發光，并采用光學分子成像設備探測到生物發光穿透生物組織，通過光信號的強度確定熒光素酶標記的干細胞的分布密度或干細胞的數量。

在步驟（2）中成功建立小動物缺血模型，結扎動脈的中間部位，保證有微弱的側枝循環，要保證缺血的效果既不能使缺血區域壞死，又要保證多只動物缺血模型的一致性。

在步驟（3）將脂肪來源的間充質干細胞多點肌肉注射到缺血損傷區域，注射的多點個數為3-5個，注射點距離血管結扎部位1-3mm。