[發(fā)明專利]缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110258049.3
• 申請日: 2011-09-02
• 公開（公告）號: CN102389297A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹豐;劉俊廷;田捷;梁繼民;范偉偉
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);西安電子科技大學(xué)
• 主分類號: A61B5/00
• 分類號: A61B5/00;A61B6/03
• 代理公司: 西安新思維專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 61114
• 代理人: 韓翎

1.缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法，其特征在于：所述的監(jiān)測步驟為：

（1）穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶和綠色熒光蛋白的干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)；

（2）構(gòu)建缺血動物模型；

（3）移植步驟（1）中培養(yǎng)的干細(xì)胞到步驟（2）所構(gòu)建的動物模型的缺血損傷區(qū)域；

（4）在第1天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天用生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，觀測時間點直到看不到發(fā)光的干細(xì)胞為止；從而可以定位干細(xì)胞在小動物體內(nèi)存在的三維空間位置和示蹤干細(xì)胞的存活情況，通過干細(xì)胞定量方法觀測干細(xì)胞在體內(nèi)不同時間點的存活數(shù)量；

（5）通過穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的干細(xì)胞進(jìn)行抗綠色熒光蛋白的抗體染色，處死動物模型并在注射干細(xì)胞的區(qū)域取肌肉組織制作冰凍切片，用熒光顯微鏡做干細(xì)胞在缺血組織中的存在性驗證；

（6）在第1天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天用micro-CT成像系統(tǒng)對動物缺血模型的微血管網(wǎng)絡(luò)成像，觀測微血管網(wǎng)絡(luò)密度是否發(fā)生了變化；

（7）由小動物缺血模型和干細(xì)胞移植后的不同時間點的干預(yù)組和對照組的血管鑄型以及血管鑄型的電鏡掃描結(jié)果來驗證micro-CT對微血管網(wǎng)絡(luò)密度變化的成像結(jié)果。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法，其特征在于：在步驟（1）中的干細(xì)胞是由穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶和綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因動物分離出來的，通過穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶在底物熒光素和氧以及三磷酸腺苷的作用下在動物體內(nèi)產(chǎn)生生物發(fā)光，并采用光學(xué)分子成像設(shè)備探測到生物發(fā)光穿透生物組織，通過光信號的強(qiáng)度確定熒光素酶標(biāo)記的干細(xì)胞的分布密度或干細(xì)胞的數(shù)量。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法，其特征在于：在步驟（2）中成功建立小動物缺血模型，結(jié)扎小動物目標(biāo)區(qū)域動脈的中間部位，并且有微弱的側(cè)枝循環(huán)以保證缺血的效果既不能使缺血區(qū)域壞死，又要保持多只動物缺血模型的一致性。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法，其特征在于：所述的移植干細(xì)胞到所構(gòu)建的動物模型缺血損傷區(qū)域，將脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞多點肌肉注射到缺血損傷區(qū)域，注射的多點個數(shù)為3-5個，注射點距離血管結(jié)扎部位1-3mm。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法，其特征在于：在步驟（4）中利用生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)對動物缺血模型中移植的干細(xì)胞進(jìn)行示蹤、觀測存活情況，首先，在成像前10分鐘對缺血動物模型注射熒光素底物每千克體重注射熒光素底物150?mg?至450mg，濃度為150?ug/ml?至450ug/ml，然后，將小動物放置到生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)的支架上，用裝有異氟烷的動物麻醉機(jī)通過氣體麻醉，并密閉暗箱，調(diào)節(jié)系統(tǒng)的成像參數(shù)，曝光時間設(shè)置為3至10分鐘、根據(jù)生物發(fā)光信號的強(qiáng)度設(shè)置科學(xué)級CCD相機(jī)的光圈范圍為1至8，采集圖像的binning值設(shè)置為4或者8，間隔90度拍攝小動物體表的4個位置的生物發(fā)光信號，并在動物體表間隔90度放置直徑為1mm的尼龍球作為標(biāo)志物，并同樣用CCD相機(jī)采集四個位置的照片，用于生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)與micro-CT系統(tǒng)的雙模態(tài)配準(zhǔn)融合，對于缺血模型還要通過與生物發(fā)光斷層成像系統(tǒng)垂直安裝的micro-CT系統(tǒng)獲得缺血模型的解剖結(jié)構(gòu)信息；對這些解剖結(jié)構(gòu)信息賦予光學(xué)參數(shù)后，進(jìn)行生物發(fā)光信號的體內(nèi)光源重建；設(shè)置micro-CT系統(tǒng)的X-ray球管電壓為50kVp、電流為0.95mA、積分時間為0.5秒、采用外觸發(fā)模式、間隔0.6度或0.75度采集一幅圖像，對動物采集360幀或480幀圖像，采集完圖像后將動物和附著在動物體表的標(biāo)記點取下，通過micro-CT采集180幀鋼珠幾何仿體、暗電流以及空掃數(shù)據(jù)，用于動物的micro-CT的校準(zhǔn)和三維重建；從而得到動物模型的三維解剖結(jié)構(gòu)信息，micro-CT重建后的解剖結(jié)構(gòu)信息與前面采集的四個位置的生物發(fā)光信號相結(jié)合即可以重建得到穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的干細(xì)胞發(fā)光的三維空間位置和光源能量的定量信息。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的缺血模型多模態(tài)分子成像監(jiān)測方法，其特征在于：對步驟（5）中的干細(xì)胞在缺血組織中的存在情況進(jìn)行驗證，通過處死缺血模型取缺血區(qū)域的肌肉組織，制作冰凍切片并用抗綠色熒光蛋白抗體染色，通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察染色后的冰凍切片來證明干細(xì)胞在缺血組織中的存在。