[發(fā)明專利]薩能羊早期胚胎性別鑒定方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110256674.4
• 申請(qǐng)日: 2011-09-01
• 公開（公告）號(hào): CN102304582A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈銀海;蘇雷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南中科胚胎工程生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

1.一種薩能羊早期胚胎性別鑒定的方法，其特征在于該方法用HOT-Start?PCR方法對(duì)薩能羊早期胚胎性別進(jìn)行鑒定，具體步驟如下：

a.用手術(shù)法對(duì)供體羊進(jìn)行沖胚，獲取胚胎；

b.取6～7d的A、B級(jí)桑椹胚和早期囊胚，進(jìn)行冷凍或直接在實(shí)驗(yàn)室對(duì)其進(jìn)行顯微取樣鑒定；

c.用吸取法對(duì)b.步驟得到的桑椹胚和早期囊胚進(jìn)行顯微取樣，對(duì)胚胎取不同的細(xì)胞數(shù)，將取樣細(xì)胞放入PCR反應(yīng)管中，準(zhǔn)備進(jìn)行DNA的提取及鑒定；取樣后的胚胎進(jìn)行發(fā)育潛能培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)；

d.PCR引物設(shè)計(jì)及模板DNA的制備：

根據(jù)GeneBank收錄的綿羊的基因序列，依據(jù)綿羊Y染色體特異重復(fù)序列(Z30265)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，同時(shí)根據(jù)綿羊的編碼肌形成蛋白(myogenin)基因(DQ453548)設(shè)計(jì)兩套對(duì)照引物，其引物序列為：

綿羊SRY基因和myogenin基因的引物序列

然后將c步驟取出的取樣細(xì)胞放入裝有10μl超純水的PCR反應(yīng)管中，用反復(fù)凍融法對(duì)取樣細(xì)胞進(jìn)行DNA提取，將裝有胚胎細(xì)胞的PCR反應(yīng)管投入液氮中5min，而后在100℃的水中煮沸5min，這個(gè)過(guò)程重復(fù)2-3次，然后將提取的DNA放入超低溫冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯舆M(jìn)行鑒定；

e.PCR擴(kuò)增體系的建立

PCR基本反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min，60℃退火30s，72℃延伸30s，35cycle結(jié)束后72℃延伸5min，反應(yīng)結(jié)束后放入4℃冰箱保存或直接以2％的agarose凝膠電泳檢測(cè)，采用25μL的PCR反應(yīng)體系，其中包括10×buffer(Mg²⁺plus)，Taq酶，6×loading?buffer，dNTP；

f.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)?

取1μl的6×loading?buffer+5μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入已經(jīng)做好的2％的agarose凝膠樣孔中，100V電壓電泳30min，溴化乙錠染色10min，凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)結(jié)果：如顯示一條302bp的SRY條帶，則為雄性，如無(wú)顯示一條302bp的SRY條帶，則為雌性。?