[發明專利]乙型肝炎病毒耐藥基因突變的檢測探針、檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201110254277.3
• 申請日: 2011-08-30
• 公開（公告）號: CN102286645A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 潘加奎
• 申請（專利權）人: 解碼（上海）生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海碩力知識產權代理事務所 31251
• 代理人: 郭桂峰

1.一種乙型肝炎病毒耐藥基因突變的檢測探針，所述的耐藥基因突變位點為rtV173L、rtL179P、rtL180M、rtA181V/T、rtT184A/G/I/S、rtA194T/M、rtA200V、rtS202G/I、rtM204V/I/S、rtV207M/I/L、rtS213T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T/D、rtK241E、rtM250V中的任意一種或幾種，其特征在于，所述的檢測探針為5’-TAGGTCTATTTACAGGCAGTTTTCG-3’。

2.一種乙型肝炎病毒耐藥基因突變的檢測試劑盒，所述的耐藥基因突變位點為rtV173L、rtL179P、rtL180M、rtA181V/T、rtT184A/G/I/S、rtA194T/M、rtA200V、rtS202G/I、rtM204V/I/S、rtV207M/I/L、rtS213T、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN238T/D、rtK241E、rtM250V中的任意一種或幾種，其特征在于，所述的試劑盒包含有用于擴增所述耐藥基因突變位點的PCR試劑和權利要求1所述的檢測探針，

所述的PCR試劑中包含有一對引物，其序列如下：

正向引物：5’-TTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCAC-3’

反向引物：5’-TAGGTCTATTTACAGGCAGTTTTCG-3’。

3.一種乙型肝炎病毒耐藥基因突變的檢測方法，其特征在于，該檢測方法使用如權利要求2所述的檢測試劑盒，其包括以下步驟：

(1)取空腹受檢者血清進行DNA抽提；

(2)使用權利要求2中所述的PCR試劑對步驟(1)所提取的DNA進行PCR擴增；

(3)將步驟(2)獲得的PCR擴增產物酶解；

(4)將權利要求1所述的檢測探針與步驟(3)所獲得的酶解產物混合進行測序PCR反應；

(5)用測序儀對步驟(4)獲得的測序PCR產物進行測序，找出所述各耐藥基因突變位點所在位置的對應序列，并與所述各耐藥基因突變位點的標準序列比較，判斷是否發生突變。

4.如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述的PCR擴增的反應體系為：PCR?Buffer?2.5μl、2.5mM的dNTP?Mix?2.5μl、5～10U的Taq酶0.2μl、0.1ug/ul?DNA模板1μl、10uM引物各1μl、ddH₂O?16.8μl；

所述的引物為權利要求2中所述的正向引物和反向引物；

反應條件為：94℃4分鐘變性和酶激活，94℃15秒變性，50℃15秒退火，72℃2分鐘延長，循環25次，最后4℃延長5分鐘以上。

5.如權利要求3或4所述的檢測方法，其特征在于，步驟(4)所述的測序PCR的反應條件為：

96℃1分鐘變性和酶激活，96℃10秒變性，50℃5秒退火，60℃4分鐘延長，循環25次，最后4℃延長5分鐘以上。