[發明專利]人工合成雞干擾素基因序列及其重組工程菌的構建與應用

有效

• 申請號: 201110251626.6
• 申請日: 2011-08-30
• 公開（公告）號: CN102321631A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 趙德剛;宋莉;盧凌霄
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12N15/21
• 分類號: C12N15/21;C12N15/23;C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;C12R1/865
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

技術領域

本發明涉及生物程領域，特別是涉及人工合成的雞干擾素基因序列，一種以釀酒酵母作為受體菌而得到的重組工程菌，其能進行胞內表達生產動物干擾素。

背景技術

釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)是一種良好的營養與保健飼料添加劑，其營養豐富，富含B族維生素、礦物質、消化酶、促生長因子和較齊全的氨基酸。使用酵母添加劑可以提高飼料蛋白含量，刺激有益菌生長，提高機體免疫力，促進營養物質消化吸收和動物生長發育。同時，釀酒酵母也是最早用于基因工程的酵母菌株，是真核生物生物學研究的模式生物，其表達蛋白能有效保持生物學活性，利用釀酒酵母表達系統，人類已經獲得一些重要藥用蛋白。

雞α干擾素(ChIFN-α)和雞γ干擾素(ChIFN-γ)具有高效廣譜的抗病毒、免疫調節、抗腫瘤細胞增殖、提高抗逆性和促進生長等多種重要生理功用，是養禽業用來防治雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、傳染性法氏囊、減蛋綜合征等多種雞病毒性傳染病的重要藥物。盡管干擾素的臨床價值極高，但是目前因生產的高昂成本卻制約著其在畜牧業中的廣泛應用。

發明內容

針對上述領域中的缺陷，本發明提供一種人工合成的雞干擾素基因序列，并提供以釀酒酵母作為受體菌而得到的重組工程菌，利用釀酒酵母作為受體菌胞內表達雞干擾素，酵母發酵產量大，產物不需分離純化，直接飼喂含有雞干擾素的酵母飼料重組菌株，可以實現畜牧業中干擾素的低成本供給問題，在提供雞體營養物質的同時達到提高其免疫力的目的，避免了疫苗注射等繁瑣管理和飼喂抗生素等藥物帶來的畜產品藥物殘留問題。

一種人工合成的雞干擾素基因YEChIFNR，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示。

一種人工合成的雞干擾素基因YEChIFNG，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO2所示。

一種重組表達載體，具有上述人工合成的雞干擾素基因YEChIFNR，或YEChIFNG，其骨架載體為pYES2/CT。

一種重組工程菌，具有上述人工合成的雞干擾素基因YEChIFNR，或YEChIFNG，所述受體菌為釀酒酵母菌株INVSc1。

上述重組工程菌生產藥用蛋白雞干擾素的方法，包括如下步驟：

(1)、酵母菌的培養：保種的重組工程菌接種于SC選擇培養基上，于30℃，200r/min過夜震蕩培養；

(2)、酵母菌的誘導表達培養：當過夜培養的新鮮菌液OD₆₀₀＝0.3-0.5時，離心收集菌體并用含半乳糖的液體誘導培養基重懸，并于30℃、200r/min振蕩培養。

所述誘導培養的條件為：誘導12h，重組菌液發酵pH值為3.8-4.0，2.5％的半乳糖濃度。

所述步驟還包括保種的重組工程菌的制備方法，將重組工程菌在YPD篩選培養基培養，菌落PCR篩選，挑取陽性克隆單菌落，SC選擇培養基，30℃振蕩過夜培養保種。

所述步驟還包括菌體細胞的裂解，所述步驟(2)的酵母菌培養到對數生長期時，取出轉速1500rpm/min離心5min收集菌體，滅菌水重懸菌體細胞之后，10000r/min離心30s，得菌體細胞用裂解緩沖液重懸。

所述菌體細胞裂解前液氮冷凍后置-80℃保存備用，裂解緩沖液重懸的OD₆₀₀＝50-100。

所述SC選擇培養基為：0.8％Ura缺陷培養基粉+2％葡萄糖；所述YPD篩選培養基為：2％胰蛋白胨+1％酵母提取物，2％葡萄糖+60mg/l?Amp(氨芐青霉素)；所述誘導培養基為0.8％Ura(尿嘧啶)缺陷培養基粉+2％半乳糖+1％棉子糖或者2％葡萄糖。

本研究通過構建雞干擾素基因ChIFN的釀酒酵母表達載體，并通過電擊法將其轉化酵母菌株INVSc1，對重組菌株的pH值、誘導時間和誘導劑濃度等誘導條件進行優化，并對重組蛋白及其生物學活性進行進檢測和分析，證明功能基因已在受體菌中獲得正確翻譯表達，重組ChIFN-α和ChIFN-γ蛋白具有抗病毒活性，為開發具有抗病功能的飼料微生物添加劑奠定了基礎。本研究對探索禽流感等病毒性疾病的防治新途徑和保證家禽的安全生產具有積極的意義。

本發明通過釀酒酵母生物反應器表達生產動物藥用蛋白，極大地降低生產成本，在給動物提供優質蛋白的同時提高機體免疫力。

本發明的總體的技術方案：包括下列步驟：