[發明專利]一種轉基因香石竹Moonlite的品系特異性定性、定量PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201110247859.9
• 申請日: 2011-08-26
• 公開（公告）號: CN102286624A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 潘愛虎;李鵬;賈軍偉;蔣玲曦;朱宏;白藍;王金斌;唐雪明
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 費開逵

技術領域

本發明屬于轉基因植物檢測技術領域，具體涉及一種轉基因香石竹Moonlite的品系特異性定性、定量PCR檢測方法。

背景技術

自從1994年第一個轉基因番茄FLAVR?SAVR被美國農業部批準進行商業化生產種植以來，越來越多的轉基因植物已用于農業生產。轉基因植物的產業化，尤其是轉基因農作物的產業化可以減少農業對環境的影響，增加糧食產量，有助于解決全球糧食問題。據統計，1996年至2010年的15年期間，轉基因農作物種植總面積超過十億公頃。轉基因農作物的種植面積從1996年的1.7萬公頃到2010年的148萬公頃，增長了87倍。2010年，全世界種植轉基因農作物的國家數量達到29個，其中19個是發展中國家。隨著轉基因植物產業化水平不斷提高，其安全問題已經引起國際社會和各國政府的廣泛關注，并成為國家之間環境保護、國際貿易等合作的敏感議題，致使轉基因產品的安全性問題由學術觀點分歧，發展到環境問題、經濟問題甚至政治問題。為了加強對轉基因植物的管理，世界各國紛紛制定了相應的法律法規。轉基因產品標識制度已成為國際公約。澳大利亞和新西蘭從2001年7月開始對所有轉基因食物實施標識制度，閾值為每種成分的1％，即當某一種成分內的轉基因成分超過1％，則必須標識為轉基因食物。巴西、以色列等國也把轉基因成分閾值定為1％。韓國和日本分別為3％和5％。

建立健全轉基因產品標識制度，轉基因產品的檢測技術是關鍵。目前世界上常用的轉基因檢測方法主要有兩種：一種是基于核酸的檢測方法，一種是基于蛋白質的免疫學檢測方法。在轉基因植物及其加工產品的檢測過程中，以DNA檢測為基礎的核酸檢測方法已經成為最主要、最適用的轉基因植物及其加工產品的檢測方法。基于DNA分子為基礎的轉基因產品檢測方法經歷了四個發展階段，即(1)針對啟動子、終止子、標記基因的篩選檢測；(2)目的基因特異性檢測；(3)基因構建特異性檢測；(4)品系特異性(轉化事件)檢測。由于品系特異性檢測方法具有高度特異性，目前國際上對于轉基因產品檢測方法已逐步過渡到品系特異性基因片段的檢測方法。

品系特異性檢測是通過分析外源插入載體與植物基因組的連接區序列實現的。由于每一個轉基因植物品系，都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區序列，并且連接區序列是單拷貝的，所以品系特異性檢測方法具有非常高的特異性和準確性。基于上述優點，品系特異性檢測已經成為目前轉基因檢測研究的重點，并將為國際檢測標準和國際各檢測實驗室所采用。許多國家已經明確規定了轉基因標簽的閾值，定量PCR檢測已經成為轉基因檢測的必須方法，該方法已經為各國轉基因檢測實驗室廣泛使用。近年來，一些轉基因植物的品系特異性定性、定量PCR檢測方法已經建立，例如，MON863，Oxy-235，MIR?604，Topas?19/2，MON15985等。

香石竹(康乃馨)是最重要的切花品種之一，其生產面積和銷售量居切花品種之首。隨著經濟發展和社會進步，人們對花卉尤其是對改變色、香、形的新品種的需求不斷增加。澳大利亞Florigene公司和日本Suntory公司將二氫黃酮醇-4-還原酶基因(DFR)和類黃酮-3′，5′-羥基化酶基因(F3′5′H)，通過農桿菌介導轉化花色為白色的香石竹品種FE123，經篩選獲得花色呈藍紫色的轉基因香石竹Moonlite。目前Moonlite已經在日本、澳大利亞、加拿大、美國、厄瓜多爾、哥倫比亞等國家通過了安全性評價，批準商品化種植。截止2008年，在美國、日本等國家銷售的Moonlite已超過一千五百萬支。

目前日本Suntory公司正在申請將轉基因香石竹Moonlite進口到中國并進行銷售，因此研究開發準確、高效的轉基因香石竹Moonlite品系特異性檢測方法，已成為一項重要而緊迫的任務。目前國內科研單位尚未進行轉基因香石竹檢測技術的研究。為了保護知識產權，便于農業行政主管部門對轉基因香石竹的監管，保護國家在世界貿易活動中的經濟利益，有必要建立轉基因香石竹Moonlite品系特異性定性、定量PCR檢測方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種轉基因花色香石竹Moonlite的品系特異性定性、定量PCR檢測方法。本發明利用TAIL-PCR技術，測序分析了外源基因插入位點左邊界旁鄰序列，并設計特異性引物和探針序列，建立了適用于轉基因香石竹Moonlite的品系特異性定性、定量PCR檢測方法，并驗證該檢測方法的特異性和靈敏度。