[發明專利]一種轉基因香石竹Moonlite的品系特異性定性、定量PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201110247859.9
• 申請日: 2011-08-26
• 公開（公告）號: CN102286624A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 潘愛虎;李鵬;賈軍偉;蔣玲曦;朱宏;白藍;王金斌;唐雪明
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 費開逵

1.一種轉基因香石竹Moonlite的品系特異性定性、定量PCR檢測方法，包括以下步驟：

1)轉基因香石竹Moonlite基因組DNA的提取；

2)轉基因香石竹Moonlite外源基因插入位點左邊界旁鄰序列的擴增和確認，其三條巢式引物LB?1R/2R/3R序列分別如SEQ?ID?No?1、SEQ?ID?No?2和SEQ?ID?No?3所示，隨機引物AD2序列如SEQ?ID?No?4所示，香石竹基因組定性PCR擴增引物對GenomeC1F/1R序列如SEQ?ID?No?9和SEQ?ID?No?10所示；

3)轉基因香石竹Moonlite的定性PCR檢測方法的建立和驗證，其Moonlite品系特異性定性引物對LiteC1F/1R序列如SEQ?ID?No?7和SEQ?IDNo?8所示，內標準基因ans特異性定性引物對ANS-F1/R1序列如SEQ?ID?No5和SEQ?ID?No?6所示；

4)轉基因香石竹Moonlite定量PCR檢測方法的建立和驗證，其Moonlite品系特異性定量引物對LiteR1F/LiteR1R和探針Lite-Probe序列分別如SEQID?No?13、SEQ?ID?No?14和SEQ?ID?No?16所示，內標準基因ans特異性定量引物對ANS-F2/ANS-R2序列和探針ANS-Probe序列如SEQ?ID?No?11、SEQID?No?12和SEQ?ID?No?15所示。

2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述外源基因插入位點左邊界旁鄰序列的擴增利用TAIL-PCR方法。

3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述TAIL-PCR方法的擴增反應體系為：第一輪擴增反應：總體積20μL，2μL?1×PCR緩沖液，0.8μL2mM?dNTPs，0.3μL?10μM所述特異性引物LB1R，4μL?10μM所述隨機引物AD2，0.2μL?5U?Taq?DNA聚合酶，2μL?Moonlite?DNA，10.7μL雙蒸水；第二輪反應：總體積25μL，2.5μL?1×PCR緩沖液，1μL?2mM?dNTPs，0.5μL?10μM所述特異性引物LB2R，5μL?10μM所述隨機引物AD2，0.16μL?5U?Taq?DNA聚合酶，14.84μL雙蒸水和1μL?40倍稀釋的第一輪PCR產物；第三輪反應：總體積50μL，5μL?1×PCR緩沖液，2μL?2mM?dNTPs，1μL?10μM所述特異性引物LB3R，10μL?10μM所述隨機引物AD2，0.3μL?5U?Taq?DNA聚合酶，30.7μL雙蒸水和1μL?10倍稀釋的第二輪PCR產物。

4.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述定性PCR檢測方法的定性PCR反應體系為：反應體系總體積25μL，5μL?Moonlite?DNA，2.5μL1×PCR緩沖液，2.5μL?2mM?dNTPs，12.7μL雙蒸水，10μM所述Moonlite品系特異性定性引物對LiteC1F/1R或所述內標準基因ans特異性定性引物對ANS-F1/R1各1μL和0.3μL?5U?Taq?DNA聚合酶；反應程序：94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，35循環；72℃，7min。

5.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述定量PCR檢測方法的PCR反應條件為：反應體系總體積25μL，2.5μL?1×PCR緩沖液，2.5μL2mM?dNTPs，5μL?25mM?MgCl₂，10μM所述Moonlite品系特異性定量引物對LiteR1F/LiteR1R或所述內標準基因ans特異性定量引物對ANS-F2/ANS-R2各0.5μL，0.5μL?10μM所述探針Lite-Probe或所述探針ANS-Probe，0.3μL?5U?Taq?DNA聚合酶，5μL?Moonlite?DNA和8.2μL雙蒸水；反應程序：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，45s，45循環。