[發明專利]一種β-半乳糖苷酶的突變體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201110247338.3
• 申請日: 2011-08-26
• 公開（公告）號: CN102337254A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 吳敬;陳晟;吳玉飛;陳堅;夏澤華
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/38
• 分類號: C12N9/38;C12N15/56;C12N15/70;C12P19/14
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種β-半乳糖苷酶突變體及其制備方法，當活性中心位點附近氨基酸發生突變后，得到活性提高的β-半乳糖苷酶，屬于基因工程和酶工程領域。?

技術背景

低聚半乳糖（GOs）是一種新型功能性低聚糖，目前已應用于嬰兒食品、烘焙食品、飲料等行業中。據統計，日本目前低聚半乳糖的年產量達6500～7000噸，僅低于低聚異麥芽糖，但年銷售額為所有功能性低聚糖之首。在歐美，人們對低聚半乳糖的需求量也日益增長。在我國，低聚半乳糖還是一個新興行業，尚未形成較大規模。在“九五”以后，在山東禹城，廣東江門等地才陸續開始了低聚半乳糖的生產，但產量有限。?

β-半乳糖苷酶是工業酶法生產低聚半乳糖的主要用酶。β-半乳糖苷酶作用于乳糖的β(1→4)糖苷鍵，形成半乳糖基-酶復合物，在該酶的轉苷活力作用下，復合物進一步與半乳糖、二糖或三糖結合，生成低聚半乳糖。不同微生物來源的β-半乳糖苷酶由于本身性質不同，合成的GOs能力也存在差異，如來源于E.?coli、A.?niger的β-半乳糖苷酶的水解活性較強，而來源于B.?circulans、A.?oryzae、Kluyveromyces?lactis的β-半乳糖苷酶則有較強的轉苷活性。目前，國內對β-半乳糖苷酶研究很多，但多為其水解方面的研究，在轉苷活性方面研究相對不足，，且工業化推廣少，限制了低聚半乳糖產能的提高。?

本發明所使用的來源于?Sulfolobus?solfataricus?P2的β-半乳糖苷酶雖然在轉化過程中能夠實現低聚半乳糖的高效生產，但是后提取工藝仍不可缺少。如何提高底物轉化率，節約成本，簡化后提取工藝將成為β-半乳糖苷酶的研究方向。?

發明內容

本發明提供了一種β-半乳糖苷酶突變體，該突變體是將硫礦硫化葉菌（Sulfolobus?solfataricus?）的β-半乳糖苷酶（NCBI編號：AAK43121）活性中心附近氨基酸的取代，與其親代β-半乳糖苷酶相比，其對乳糖具有更高的轉化率。?

所述β-半乳糖苷酶突變體是441位氨基酸苯丙氨酸突變為酪氨酸，命名為F441Y。?

本發明應用于低聚半乳糖的生產，最適溫度為70℃，最適pH為6.5。?

本發明在構建的突變株的基礎上優化了突變體酶的酶轉化條件，實現了低聚半乳糖產量的提高，具有較高的工業價值。使用本突變體生產低聚半乳糖，在最優酶轉化條件下，突變體酶F441Y生產的低聚半乳糖的產率達到61%，較野生酶高10%左右。?

附圖說明

圖1利用野生酶轉化乳糖生成低聚半乳糖的最適溫度;?

圖2利用突變酶轉化乳糖生成低聚半乳糖的最適溫度;

圖3利用野生酶轉化乳糖生成低聚半乳糖的最適Ph;

圖4利用突變酶轉化乳糖生成低聚半乳糖的最適pH。

具體實施方式

實施例1：本例說明野生β-半乳糖苷酶的制備。

、β-半乳糖苷酶的克隆

培養硫礦硫化葉菌P2（購自ATCC，ATCC編號：35095），并提取其總DNA。

根據硫礦硫化葉菌的β-糖苷酶的基因lacS基因(NCBI編號：AE006641)設計引物：?

正向引物P1：?GTCTGCATATGTACTCATTTCCAAATAGC(下劃線為酶切位點)

反向引物P2：?GAATCTCGAGTTAGTGCCTTAATGGCTTTAC(下劃線為酶切位點)

利用上述引物，以硫礦硫化葉菌P2的總DNA為模板，PCR擴增β-半乳糖苷酶基因，反應在50μL體系中進行。反應條件為：?94℃?預變性4?min；隨后進行30個循環(94℃?10?s，60℃?5?s，72℃?1min50s)；?72℃延伸10?min；最后4℃?保溫。擴增得到的PCR片段，經膠回收后，與pMD18-?T?simple載體連接，并將連接產物轉化至大腸桿菌JM109，轉化產物涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37℃培養過夜，平板上挑5個菌落，接入LB液體培養基，8h后抽提質粒并測序，結果正確。

、β-半乳糖苷酶的表達與制備：