[發(fā)明專利]脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110246399.8
• 申請日: 2011-08-24
• 公開（公告）號: CN102304576A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉萍;李健;賈舒雯
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 青島聯(lián)智專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 37101
• 代理人: 楊秉利

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子遺傳標(biāo)記領(lǐng)域，尤其涉及一種脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測方法。

背景技術(shù)

微衛(wèi)星(microsatellites)?或稱簡單序列重復(fù)(simple?sequence?repeats?,?SSR)?是指由1～6?個核苷酸組成的簡單串聯(lián)重復(fù)DNA?序列。迄今研究過的所有生物種類中都發(fā)現(xiàn)了它的存在，并且分布密度很大。由于微衛(wèi)星廣泛分布于基因組中，具有密度大、多態(tài)性豐富、高度雜合且穩(wěn)定性好、遵循孟德爾分離定律共顯性遺傳、易于PCR?擴增等特點，已成為近年來最引人注目的新型DNA?標(biāo)記,并廣泛應(yīng)用于生物資源的家系譜系認證、基因連鎖分析、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、種群遺傳多樣性等許多研究領(lǐng)域。

國內(nèi)外在其他海產(chǎn)甲殼類有相關(guān)的研究報道，利用尼龍膜雜交法，Masatsugu?takhano?等在鋸緣青蟹（正蟳，Scylla?serrata）中發(fā)現(xiàn)5個具有可變性的微衛(wèi)星位點。David?Gopurenko等在鋸緣青蟹（沙蟳，Scylla?paramamosain）的研究中篩選到5個微衛(wèi)星位點。利用常規(guī)方法，E.S?Yap等在遠海梭子蟹（Portunus?pelagicus）中篩選到7個含有二核苷酸重復(fù)單元、1個含有四核苷酸重復(fù)單元的微衛(wèi)星位點。H.S.AN等利用PCR篩選法，在中華絨螯蟹（Eriocheir?sinensis）基因組富集文庫中篩選出9個新的微衛(wèi)星位點。B.H?nfling等在中華絨螯蟹中篩選到12個具有高度多態(tài)性的微衛(wèi)星位點。劉萍以及徐鵬等開發(fā)了中國對蝦（Fenneropenaeus?chinensis）微衛(wèi)星標(biāo)記，并用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、系譜認證和群體遺傳多樣性的分析等；王鴻霞等以人工選育建立的凡納濱對蝦全同胞家系為實驗材料，探討了微衛(wèi)星標(biāo)記對混養(yǎng)家系進行親權(quán)鑒定的可能性；欒生建立了日本對蝦（Marsupenaeus?japonicus）微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)；李曉萍等構(gòu)建了三疣梭子蟹（Portunus?triuberbuculatus）基因組富集文庫，獲得了30個多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，并用于群體遺傳分析。馮建彬等利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析了日本沼蝦（Macrobrachium?mipponensis）9個野生群體遺傳多樣性。這些重要經(jīng)濟甲殼類的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的開發(fā)，已應(yīng)用于親緣關(guān)系鑒定、種群多樣性研究中。但是至今為止，尚未見有脊尾白蝦微衛(wèi)星DNA檢測技術(shù)方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中尚未有對脊尾白蝦微衛(wèi)星DNA檢測方法公開的現(xiàn)狀，提供了一種脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測方法，本發(fā)明可快捷的獲得脊尾白蝦EcSSR0003遺傳標(biāo)記基因座位呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜，方法簡便，所得結(jié)果可直觀地檢測出脊尾白蝦在此位點的每個個體的基因型。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測方法，所述檢測方法包括以下步驟：首先提取脊尾白蝦基因組DNA并稀釋備用；再利用脊尾白蝦基因組文庫中的EcSSR0003微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計特異性引物；然后使用該引物對脊尾白蝦不同地理群或群內(nèi)個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行檢測；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進行分析，確定每個個體的基因型，從而獲得脊尾白蝦在EcSSR0003核心序列區(qū)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜；

所述EcSSR0003微衛(wèi)星核心序列的特異性引物序列分別為：正鏈5’-?AGGCAACAGGACATAACA?-3’，負鏈3’-?CGTACAGATAGACGGAGA?-5’，使用特異性引物時的退火溫度為51℃。

對技術(shù)方案的進一步改進：所述脊尾白蝦基因組DNA的稀釋濃度為50ng/μL，每個PCR反應(yīng)中加入3μL，反應(yīng)總體積為20μL。

對技術(shù)方案的進一步改進：所述PCR擴增的反應(yīng)體系為：每個PCR反應(yīng)總體積為20μL，包括50ng/μL脊尾白蝦基因組DNA3μL；2.5mmol/L?dNTP?1.6μL；含15?mmol/L?Mg2+?的10×PCR?Buffer?2μL；5U/μL的Taq酶0.2μL；引物10mmol/L各1μL；最后加ddH2O至20μL。

對技術(shù)方案的進一步改進：使用所述特異性引物時設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性45s，51℃退火45s，72℃延伸45s，25個循環(huán)；最后72℃再延伸10min；4℃保存。