[發(fā)明專利]脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110246399.8
• 申請(qǐng)日: 2011-08-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102304576A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉萍;李健;賈舒雯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 青島聯(lián)智專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 37101
• 代理人: 楊秉利

1.脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法包括以下步驟：首先提取脊尾白蝦基因組DNA并稀釋備用；再利用脊尾白蝦基因組文庫(kù)中的EcSSR0003微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對(duì)脊尾白蝦不同地理群或群內(nèi)個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進(jìn)行分析，確定每個(gè)個(gè)體的基因型，從而獲得脊尾白蝦在EcSSR0003核心序列區(qū)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜；

所述EcSSR0003微衛(wèi)星核心序列的特異性引物序列分別為：正鏈5’-?AGGCAACAGGACATAACA?-3’，負(fù)鏈3’-?CGTACAGATAGACGGAGA?-5’，使用特異性引物時(shí)的退火溫度為51℃。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于：所述脊尾白蝦基因組DNA的稀釋濃度為50ng/μL，每個(gè)PCR反應(yīng)中加入3μL，反應(yīng)總體積為20μL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：每個(gè)PCR反應(yīng)總體積為20μL，包括50ng/μL脊尾白蝦基因組DNA3μL；2.5mmol/L?dNTP?1.6μL；含15?mmol/L?Mg2+?的10×PCR?Buffer?2μL；5U/μL的Taq酶0.2μL；引物10mmol/L各1μL；最后加ddH2O至20μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于：使用所述特異性引物時(shí)設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性45s，51℃退火45s，72℃延伸45s，25個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10min；4℃保存。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的脊尾白蝦EcSSR0003微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于：對(duì)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)：將PCR產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠，12W恒功率電泳1～1.5h進(jìn)行分離；將膠板通過(guò)10%的冰醋酸溶液20min→蒸餾水6min→0.1%的硝酸銀溶液25min→3%的碳酸鈉溶液顯色數(shù)分鐘，終止反應(yīng)即可得到脊尾白蝦在EcSSR0003基因座位高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜。